三種牙髓治療材料對(duì)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞及牙周韌帶細(xì)胞增殖和分化影響的研究.pdf

1、本研究擬在體外分別培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞(humanDentalPulpCells，hDPCs)和人牙周韌帶細(xì)胞(humanPeriodontalLigamentCells，hPDLCs)，研究氫氧化鈣、羥基磷灰石、三氧化礦物凝聚體三種材料浸提液對(duì)hDPCs和hPDLCs增殖、分化以及p38MAPK信號(hào)蛋白表達(dá)的影響，從細(xì)胞水平和分子水平比較這三種材料的生物活性，初步探討生物材料誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的機(jī)制。　　研究材料和方法： ①用組織塊

2、法和酶消化法進(jìn)行人hDPCs的原代培養(yǎng)，用組織塊法進(jìn)行牙周韌帶細(xì)胞的原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，取第5代hDPCs和hPDLCs用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，用SABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞來(lái)源鑒定。 ②配制氫氧化鈣、納米羥基磷灰石、三氧化礦物凝聚體三種材料浸提液，按體積分?jǐn)?shù)稀釋成不同濃度。取第5代hDPCs和hPDLCs，消化后以2×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分別用不同濃度的材

3、料浸提液培養(yǎng)，收集培養(yǎng)第2d、4d、6d、8d的細(xì)胞，用MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖情況。 ③取第3代hDPCs和hPDLCs，消化后以5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分別于培養(yǎng)的3d、6d、9d測(cè)定各材料浸提液培養(yǎng)細(xì)胞的ALP活性，以研究細(xì)胞分化的情況。 ④用各材料浸提液培養(yǎng)hDPCs和hPDLCs，用VonKossa染色檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)的形成，用免疫組化染色檢測(cè)骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)的表達(dá)。⑤

4、用Western-blot檢測(cè)Ca(OH)2和MTA浸提液對(duì)細(xì)胞p38MAPK蛋白的表達(dá)，并分別以礦化誘導(dǎo)液和DMEM作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。 ⑤在MTA浸提液和礦化誘導(dǎo)液中加入不同濃度的SB302580后與hDPCs和hPDLCs共培養(yǎng)，檢測(cè)SB302580對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響。 研究結(jié)果： ①hDPCs最早在第6d長(zhǎng)出，呈梭形，核仁清晰，胞漿豐滿。一般于15-20d長(zhǎng)滿瓶底，可進(jìn)行傳代；酶消化法可在消化后2

5、d見(jiàn)到細(xì)胞貼壁。hPDLCs最早在第4d長(zhǎng)出，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，可見(jiàn)多邊形及三角形細(xì)胞，一般于12-15d可長(zhǎng)滿瓶底進(jìn)行傳代。免疫組化染色結(jié)果顯示hDPCs和hPDLCs波形絲蛋白為陽(yáng)性，抗角蛋白染色為陰性。 ②用MTT法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的第2d、4d、6d、8d的活性，結(jié)果表明Ca(OH)2組細(xì)胞OD值明顯低于其它各組(P＜0.05)，其它各組之間OD值大小無(wú)差別(P＞0.05)，材料浸提液的濃度對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞OD值大小無(wú)明顯影響(P＞

6、0.05)，HDPCs組與HPDLCs組細(xì)胞的OD值差別不大(P＞0.05)。 ③檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的3d、6d、9dALP的活性，結(jié)果表明MTA組細(xì)胞的OD值高于Ca(OH)2組和n-HA組(P＜0.05)，Ca(OH)2組細(xì)胞ALP活性的相對(duì)增長(zhǎng)率高于完全培養(yǎng)液組和n-HA組，低于MTA組(P＜0.05)。MTA浸提液培養(yǎng)9d后HDPCs細(xì)胞ALP活性O(shè)D值略低于HPDLCs(P＜0.05)。 ④MTA浸提液培養(yǎng)的hDPC

7、s和hPDLCs，VonKossa染色和OCN免疫組化呈陽(yáng)性，其它組為陰性。 ⑤hDPCs和hPDLCs中p38MAPK的表達(dá)在換液后3h達(dá)到最高，MTA浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞中有p38MAPK的表達(dá)，Ca(OH)2組細(xì)胞則無(wú)表達(dá)。⑤礦化誘導(dǎo)液和MTA浸提液中加入SB302580時(shí)，所培養(yǎng)的細(xì)胞ALP活性O(shè)D值呈濃度依賴性下降。 研究結(jié)論： ①用組織塊法和酶消化法成功培養(yǎng)出人牙髓細(xì)胞；用組織塊法成功培養(yǎng)人牙周韌帶細(xì)胞。

8、 ②Ca(OH)2對(duì)兩種細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，但可促進(jìn)存活細(xì)胞的分化。 ③n-HA對(duì)細(xì)胞的增殖和分化無(wú)明顯促進(jìn)作用，也無(wú)明顯抑制作用。 ④MTA對(duì)hDPCs和hPDLCs的增殖無(wú)抑制，可以誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化或礦化分化。 ⑤hDPCs和hPDLCs對(duì)材料增殖敏感性無(wú)差異，在MTA和礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)下hPDLCs分化的能力略強(qiáng)于hDPCs。 ⑥MTA誘導(dǎo)人hDPCs和hPDLCs成骨分化或礦化分化的