LPS對人牙髓干細(xì)胞增殖定向分化能力的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、近年來隨著人們對成體干細(xì)胞的研究越來越深入,發(fā)現(xiàn)其在組織再生和損傷修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮著非常重要的作用。牙髓干細(xì)胞作為存在于牙髓組織的一種成體干細(xì)胞,也是口腔生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。它具有很強(qiáng)的增殖能力,在體外經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)又能向成骨/成牙、成脂、成神經(jīng)等方向分化。同時眾多的研究也發(fā)現(xiàn)移植到體內(nèi)的牙髓干細(xì)胞能夠形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。因此,牙髓干細(xì)胞成功體外分離為構(gòu)建組織工程牙齒和牙髓損傷修復(fù)的研究提供了重大的契機(jī)。
　　細(xì)菌內(nèi)毒素脂多

2、糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌主要的致病因子。研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠與細(xì)胞表面特異性受體TLR4結(jié)合調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。而齲病致牙髓損傷時,脫礦牙本質(zhì)能釋放TGFβl等眾多生長因子,促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向OBLC分化。而細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物也會進(jìn)入牙髓,接觸刺激牙髓干細(xì)胞,那么細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物如LPS是否影響牙髓干細(xì)胞增殖和定向分化能力?目前尚不清楚。為此,本課題在成功構(gòu)建牙髓干細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,用LPS對牙髓干細(xì)

3、胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇碳?旨在探索其對牙髓干細(xì)胞增殖分化能力的影響。我們還初步分析了MAPK信號通路在LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞分化過程中作用。我們的研究結(jié)果如下:
　　1.牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　我們通過酶消化組織塊法分離培養(yǎng)原代細(xì)胞,采用有限稀釋法對得到的原代細(xì)胞進(jìn)行純化,獲得相對較為純化均一的牙髓干細(xì)胞系。然后,我們采用了一系列針對干細(xì)胞生物學(xué)特性的方法對獲得的干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的表型進(jìn)行分析,同時對

4、細(xì)胞多向分化能力的進(jìn)行了檢測,結(jié)果均符合公認(rèn)的DPSCs的生物學(xué)特征,證明我們已經(jīng)成功的構(gòu)建了hDPSCs細(xì)胞系。
　　2.LPS對人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響
　　我們通過LPS刺激二維平面和三維立體培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞檢測其對hDPSCs增殖能力的影響。不同濃度的LPS(0.01-10ug/ml)刺激二維平面培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞,MTT檢測結(jié)果顯示LPS在短時間的培養(yǎng)時間(1-5d)內(nèi)對hDPSCs的增殖能力影響不大,7d時與無刺

5、激因素的對照組相比,各刺激組均出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象;而用1ug/mlLPS刺激復(fù)合在HA/TCP支架材料上三維立體培養(yǎng)的hDPSCs,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)7d組與3d組比較細(xì)胞數(shù)目明顯增多;而3d、7d分別將對照組與LPS刺激組相比細(xì)胞數(shù)目無顯著差異,14d時LPS刺激組較對照組相比細(xì)胞數(shù)目明顯減少。提示LPS長期刺激牙髓干細(xì)胞可能會抑制其增殖能力。
　　3.LPS對人牙髓干細(xì)胞定向分化能力的影響
　　首先,我們通過實時定量PCR檢測在牙

6、髓干細(xì)胞分化過程中TLR4及相關(guān)礦化基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)TLR4在牙髓干細(xì)胞表面表達(dá),而且牙髓干細(xì)胞分化7天時表達(dá)達(dá)到最高峰,提示LPS特異性受體TLR4很可能在牙髓干細(xì)胞分化早期發(fā)揮重要作用。礦化基因DSPP、DMP1、ALP、OPN在牙髓干細(xì)胞在分化過程中均有不同程度的升高。隨后,我們分別通過實時定量PCR和茜素紅染色分別檢測LPS在牙髓干細(xì)胞分化過程中對礦化相關(guān)基因表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)形成情況的影響,結(jié)果顯示LPS能夠顯著的促進(jìn)礦化相關(guān)基

7、因DSPP、DMP1、ALP、OPN的表達(dá);同時LPS刺激也能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成。我們又通過電鏡觀察LPS對三維培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞胞外基質(zhì)分泌情況的影響,發(fā)現(xiàn)LPS刺激能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)及膠原纖維樣結(jié)構(gòu)的形成。以上結(jié)果證實LPS能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的定向分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。以上研究結(jié)果與體內(nèi)牙髓損傷修復(fù)的過程類似,該部分的研究為探明牙髓損傷修復(fù)的機(jī)制提供了可靠的體外研究模型。
　　4.MAPK信號通路在LPS調(diào)

8、控的人牙髓干細(xì)胞定向分化過程中作用的研究
　　為了探索牙髓損傷修復(fù)的分子機(jī)制,我們對MAPK信號通路在LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞定向分化過程的作用也進(jìn)行了初步的分析。通過茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色和實時定量PCR分析,我們發(fā)現(xiàn)同時阻斷ERK1/2和p38MAPK信號通路后,LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)和礦化基因表達(dá)均發(fā)生明顯的降低,而阻斷JNK對兩者的影響卻不是很顯著。另外,Western blot檢測結(jié)果也顯示LPS能夠活化p38、ERK

9、1/2激酶,且酶的活性隨著LPS作用時間的延長而明顯增強(qiáng)。說明ERK1/2和p38MAPK信號通路參與了LPS對牙髓干細(xì)胞的定向分化過程的調(diào)控,并在其中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用,而JNK信號通路可能不參與其中。這為探索牙髓損傷修復(fù)的機(jī)制研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　綜上所述,LPS對牙髓干細(xì)胞的增殖能力和定向分化能力均有不同程度的影響,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2和p38MAPK信號通路參與LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞分化過程,并在其中發(fā)揮著正