LPS對人牙髓干細胞增殖定向分化能力的影響及其相關(guān)機制的研究.pdf

1、近年來隨著人們對成體干細胞的研究越來越深入,發(fā)現(xiàn)其在組織再生和損傷修復領域發(fā)揮著非常重要的作用。牙髓干細胞作為存在于牙髓組織的一種成體干細胞,也是口腔生物學領域的研究熱點。它具有很強的增殖能力,在體外經(jīng)過適當?shù)恼T導又能向成骨/成牙、成脂、成神經(jīng)等方向分化。同時眾多的研究也發(fā)現(xiàn)移植到體內(nèi)的牙髓干細胞能夠形成牙髓牙本質(zhì)復合體樣結(jié)構(gòu)。因此,牙髓干細胞成功體外分離為構(gòu)建組織工程牙齒和牙髓損傷修復的研究提供了重大的契機。
　　細菌內(nèi)毒素脂多

2、糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌主要的致病因子。研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠與細胞表面特異性受體TLR4結(jié)合調(diào)控間充質(zhì)干細胞的分化。而齲病致牙髓損傷時,脫礦牙本質(zhì)能釋放TGFβl等眾多生長因子,促進牙髓干細胞向OBLC分化。而細菌及其毒性產(chǎn)物也會進入牙髓,接觸刺激牙髓干細胞,那么細菌及其毒性產(chǎn)物如LPS是否影響牙髓干細胞增殖和定向分化能力?目前尚不清楚。為此,本課題在成功構(gòu)建牙髓干細胞系的基礎上,用LPS對牙髓干細

3、胞進行適當?shù)拇碳?旨在探索其對牙髓干細胞增殖分化能力的影響。我們還初步分析了MAPK信號通路在LPS調(diào)控的牙髓干細胞分化過程中作用。我們的研究結(jié)果如下:
　　1.牙髓干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　我們通過酶消化組織塊法分離培養(yǎng)原代細胞,采用有限稀釋法對得到的原代細胞進行純化,獲得相對較為純化均一的牙髓干細胞系。然后,我們采用了一系列針對干細胞生物學特性的方法對獲得的干細胞進行了鑒定。通過流式細胞儀對細胞的表型進行分析,同時對

4、細胞多向分化能力的進行了檢測,結(jié)果均符合公認的DPSCs的生物學特征,證明我們已經(jīng)成功的構(gòu)建了hDPSCs細胞系。
　　2.LPS對人牙髓干細胞增殖能力的影響
　　我們通過LPS刺激二維平面和三維立體培養(yǎng)的牙髓干細胞檢測其對hDPSCs增殖能力的影響。不同濃度的LPS(0.01-10ug/ml)刺激二維平面培養(yǎng)的牙髓干細胞,MTT檢測結(jié)果顯示LPS在短時間的培養(yǎng)時間(1-5d)內(nèi)對hDPSCs的增殖能力影響不大,7d時與無刺

5、激因素的對照組相比,各刺激組均出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象;而用1ug/mlLPS刺激復合在HA/TCP支架材料上三維立體培養(yǎng)的hDPSCs,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)7d組與3d組比較細胞數(shù)目明顯增多;而3d、7d分別將對照組與LPS刺激組相比細胞數(shù)目無顯著差異,14d時LPS刺激組較對照組相比細胞數(shù)目明顯減少。提示LPS長期刺激牙髓干細胞可能會抑制其增殖能力。
　　3.LPS對人牙髓干細胞定向分化能力的影響
　　首先,我們通過實時定量PCR檢測在牙

6、髓干細胞分化過程中TLR4及相關(guān)礦化基因表達情況,發(fā)現(xiàn)TLR4在牙髓干細胞表面表達,而且牙髓干細胞分化7天時表達達到最高峰,提示LPS特異性受體TLR4很可能在牙髓干細胞分化早期發(fā)揮重要作用。礦化基因DSPP、DMP1、ALP、OPN在牙髓干細胞在分化過程中均有不同程度的升高。隨后,我們分別通過實時定量PCR和茜素紅染色分別檢測LPS在牙髓干細胞分化過程中對礦化相關(guān)基因表達和礦化結(jié)節(jié)形成情況的影響,結(jié)果顯示LPS能夠顯著的促進礦化相關(guān)基

7、因DSPP、DMP1、ALP、OPN的表達;同時LPS刺激也能促進牙髓干細胞礦化結(jié)節(jié)的形成。我們又通過電鏡觀察LPS對三維培養(yǎng)的牙髓干細胞胞外基質(zhì)分泌情況的影響,發(fā)現(xiàn)LPS刺激能夠促進牙髓干細胞分泌胞外基質(zhì)及膠原纖維樣結(jié)構(gòu)的形成。以上結(jié)果證實LPS能夠促進牙髓干細胞的定向分化為成牙本質(zhì)樣細胞。以上研究結(jié)果與體內(nèi)牙髓損傷修復的過程類似,該部分的研究為探明牙髓損傷修復的機制提供了可靠的體外研究模型。
　　4.MAPK信號通路在LPS調(diào)

8、控的人牙髓干細胞定向分化過程中作用的研究
　　為了探索牙髓損傷修復的分子機制,我們對MAPK信號通路在LPS調(diào)控的牙髓干細胞定向分化過程的作用也進行了初步的分析。通過茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色和實時定量PCR分析,我們發(fā)現(xiàn)同時阻斷ERK1/2和p38MAPK信號通路后,LPS調(diào)控的牙髓干細胞礦化結(jié)節(jié)和礦化基因表達均發(fā)生明顯的降低,而阻斷JNK對兩者的影響卻不是很顯著。另外,Western blot檢測結(jié)果也顯示LPS能夠活化p38、ERK

9、1/2激酶,且酶的活性隨著LPS作用時間的延長而明顯增強。說明ERK1/2和p38MAPK信號通路參與了LPS對牙髓干細胞的定向分化過程的調(diào)控,并在其中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用,而JNK信號通路可能不參與其中。這為探索牙髓損傷修復的機制研究奠定了一定的基礎。
　　綜上所述,LPS對牙髓干細胞的增殖能力和定向分化能力均有不同程度的影響,進一步研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2和p38MAPK信號通路參與LPS調(diào)控的牙髓干細胞分化過程,并在其中發(fā)揮著正