A2AR活化在腦創(chuàng)傷后tau蛋白過度磷酸化及認(rèn)知障礙中的作用與機(jī)制.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展,由交通事故、戰(zhàn)爭以及激烈對抗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)及傷后遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率逐年增高。TBI后認(rèn)知障礙起病隱匿,多在傷后幾年或數(shù)十年發(fā)病,并可進(jìn)行性發(fā)展。對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等神經(jīng)退行性疾病的研究表明tau蛋白過度磷酸化與認(rèn)知功能障礙的發(fā)生有關(guān)。近來有研究發(fā)現(xiàn)TBI后患者腦中存在異常過度磷酸化的tau蛋白。但是,tau蛋

2、白過度磷酸化是否與 TBI后慢性期認(rèn)知功能障礙的發(fā)生有關(guān)仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)PKA、GSK-3β是大腦中引起tau蛋白發(fā)生過度磷酸化反應(yīng)的主要激酶,PKA可以易化 GSK-3β對 tau蛋白的磷酸化作用。顱腦創(chuàng)傷后細(xì)胞內(nèi)腺苷合成增多或直接由ATP轉(zhuǎn)化的腺苷增加導(dǎo)致腦內(nèi)腺苷含量迅速升高,并激活腺苷 A2A受體(Adenosine A2A receptor,A2AR)。A2AR在調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、神經(jīng)興奮性、突觸可塑性、膠質(zhì)細(xì)胞的功能以

3、及認(rèn)知功能方面發(fā)揮重要作用,PKA是A2AR活化后發(fā)揮生物效應(yīng)的經(jīng)典下游分子之一。抑制A2AR的活化可改善腦創(chuàng)傷后的某些認(rèn)知功能障礙。但目前還不知道在腦外傷這一致病條件下,抑制A2AR活化對認(rèn)知功能的保護(hù)效應(yīng)是否與降低tau蛋白磷酸化水平有關(guān),如果有關(guān)又是通過什么信號(hào)通路對tau蛋白磷酸化水平進(jìn)行調(diào)控的。
　　我們的研究中,首先在左側(cè)頂葉皮層固定位置應(yīng)用可控皮質(zhì)打擊方法(Controlled cortical impact,CCI

4、)建立TBI模型,通過檢測傷后24h小鼠腦含水量及神經(jīng)功能缺損評分,達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)室前期建立的小鼠中度 TBI模型標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)及western blot方法檢測TBI致傷后24小時(shí)、7天、4周不同腦區(qū)tau蛋白在Thr205、Ser262及Ser404位點(diǎn)磷酸化水平改變。我們發(fā)現(xiàn)傷后各時(shí)間點(diǎn)小鼠傷灶周圍皮層、傷側(cè)海馬及損傷對側(cè)海馬齒狀回等腦區(qū)tau蛋白C端Ser404位點(diǎn)磷酸化水平與假手術(shù)組相比顯著升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn),在發(fā)生tau蛋

5、白C端過度磷酸化的腦區(qū)也存在著GFAP抗體標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、Neun抗體標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量減少及淀粉樣肽前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)堆積顯示的軸突損傷。進(jìn)而,我們通過在傷后15min于小鼠腹腔注射A2AR特異性抑制劑ZM241385或使用A2AR基因敲除小鼠觀察各腦區(qū)tau蛋白磷酸化水平是否改變以及認(rèn)知功能能否得到緩解。發(fā)現(xiàn)TBI后抑制A2AR的活化可以顯著降低tau蛋白C端Ser404位點(diǎn)

6、磷酸化水平。傷后7天、4周進(jìn)行行為學(xué)檢測,發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能(參考記憶、工作記憶)也可得到不同程度的緩解。進(jìn)而我們通過培養(yǎng)原代大鼠海馬神經(jīng)元及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y,在A2AR激動(dòng)劑CGS241385的作用下分別或同時(shí)使用PKA特異性抑制劑H-89及CGS-3β抑制劑SB216763,檢測tau蛋白Ser404位點(diǎn)磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)A2AR活化對tau蛋白的磷酸化作用可能是通過活化PKA,易化GSK-3β對tau蛋白Ser404位點(diǎn)的

7、磷酸化作用實(shí)現(xiàn)的。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論:
　　1、TBI后在傷側(cè)皮層海馬及對側(cè)海馬齒狀回存在tau蛋白的過度磷酸化,這一磷酸化主要體現(xiàn)在其 C端的 Ser404位點(diǎn),而突出區(qū)結(jié)構(gòu)域(projection domain,P區(qū))的Thr205位點(diǎn)及微管結(jié)合區(qū)(microtubule binding domain,MBD區(qū))的Ser262位點(diǎn)磷酸化水平始終未見顯著改變。這一效應(yīng)不僅存在于傷后早期24小時(shí),在亞急性期(傷后7d)

8、及慢性期(傷后4w)tau蛋白在該位點(diǎn)的磷酸化水平依然高于假手術(shù)組。以上結(jié)果表明TBI后持續(xù)存在tau蛋白C端過度磷酸化,而且有不同于其他神經(jīng)退行性疾病的時(shí)空分布特點(diǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)傷后各時(shí)間點(diǎn)在發(fā)生 tau蛋白過度磷酸化的對側(cè)齒狀回及鄰近腦區(qū)還同時(shí)存在膠質(zhì)增生、神經(jīng)元丟失及軸突損傷等重要神經(jīng)病理改變。這些病變發(fā)生于與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的海馬齒狀回腦區(qū),根據(jù) tau蛋白過度磷酸化可以損傷軸漿運(yùn)輸功能的文獻(xiàn)報(bào)道,以上結(jié)果提示我們TBI后

9、慢性期認(rèn)知功能障礙可能與過度磷酸化的tau蛋白引起軸漿運(yùn)輸功能受損及齒狀回神經(jīng)元丟失有關(guān)。
　　2、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TBI后拮抗 A2AR或基因敲除可在傷后亞急性期及慢性期不同程度改善小鼠空間參考記憶及工作記憶功能障礙。對各組小鼠大腦進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)拮抗A2AR活化可顯著降低損傷對側(cè)齒狀回tau蛋白C端Ser404位點(diǎn)的磷酸化水平,改善膠質(zhì)增生、軸突損傷及神經(jīng)元丟失等病理改變。以上結(jié)果提示TBI后抑制A2AR活化對認(rèn)知功能

10、的保護(hù)作用可能與降低tau蛋白的磷酸化水平有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)特異性激活A(yù)2AR可使原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的tau蛋白Ser404位點(diǎn)磷酸化水平升高,并呈現(xiàn)出神經(jīng)元軸突對線粒體的運(yùn)輸功能障礙。這進(jìn)一步肯定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中A2AR活化對tau蛋白的磷酸化作用及其通過影響軸漿運(yùn)輸功能損傷神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)毒性的一面。
　　3、在 SH-SY5Y細(xì)胞中分別抑制 PKA、GSK-3β或聯(lián)合使用二者都可顯著降低A2AR活化引起的tau蛋白磷酸化水平

11、升高。聯(lián)系其他研究中所發(fā)現(xiàn)的PKA、GSK-3β對tau蛋白磷酸化作用位點(diǎn)及兩種激酶相互作用關(guān)系的報(bào)道,我們認(rèn)為TBI后A2AR活化引起tau蛋白磷酸化水平升高是通過激活PKA,易化了GSK-3β對tau蛋白C端Ser404位點(diǎn)的磷酸化作用實(shí)現(xiàn)的。
　　上述研究結(jié)果表明,腦創(chuàng)傷后A2AR的活化是導(dǎo)致tau蛋白磷酸化水平升高進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要原因,這一作用是通過激活PKA易化GSK-3β對tau蛋白C端Ser404位點(diǎn)的磷酸