異常A2AR信號促進TBI后多腦區(qū)磷酸化tau蛋白增多及空間記憶障礙的機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)以其高死亡率及嚴重的后遺效應受到社會的廣泛關注。認知功能障礙是TBI慢性期嚴重影響患者生活質量的并發(fā)癥，空間記憶障礙是認知功能損傷后的重要表現(xiàn)。TBI患者腦內可檢出過度磷酸化tau蛋白及其聚合或纏結產物，這些產物統(tǒng)稱為tau蛋白病變，它是以認知障礙為主要特征的阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的典型病理改變之一。因此，包括慢性創(chuàng)傷性腦病在內的TBI

2、后情感、認知功能障礙類疾病及其他含有tau蛋白病變的神經退行性疾病被統(tǒng)稱為tau蛋白病。近年對AD的研究發(fā)現(xiàn)tau蛋白病變可在腦內復制及傳播，可能是病情進展的重要機制。而TBI所致空間記憶障礙患者腦內tau蛋白病變的出現(xiàn)早于AD等其他神經退行性疾病，腦區(qū)分布規(guī)律也具有自己的特點。這些是否是導致TBI后認知障礙早期出現(xiàn)的原因目前仍不明確。
　　TBI后大量產生的腺苷可以激活腺苷A2A受體(Adenosine A2A Receptor

3、, A2AR)，研究結果表明拮抗A2AR可以降低AD患者腦內tau蛋白磷酸化水平、減少淀粉樣斑塊的堆積，并顯著改善認知功能、情感障礙等神經功能異常。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)的“類淋巴”系統(tǒng)在星形膠質細胞水流的介導下參與清除細胞外代謝廢物。水通道蛋白4(AQP4)在血管周圍星形膠質細胞終足的極性分布是類淋巴系統(tǒng)中介導物質清除的星形膠質細胞水流定向流動的關鍵，受星形膠質細胞活化及磷酸化修飾調控。而A2AR的激活與星形膠質細胞的活化及cAMP/PK

4、A等信號通路關系密切。因此我們希望通過本課題的研究探索A2AR促進TBI后多個腦區(qū)p-tau產生增多及清除障礙的機制及與空間記憶功能障礙的關系。
　　本研究中，我們使用可控皮質打擊方法(controlled cortical impact，CCI)建立中度TBI模型。應用免疫組織化學、western blot等方法檢測TBI后24 h、7d及4w小鼠腦內tau蛋白磷酸化水平升高的時間、空間及細胞分布規(guī)律。進而在A2AR基因敲除小鼠

5、及藥理學干預等條件下在動物整體水平檢測TBI后A2AR活化引起的神經元內tau蛋白磷酸化水平升高及相關軸突、樹突損傷情況;通過行為學實驗檢測空間記憶（空間參考記憶及空間工作記憶）功能障礙;免疫熒光方法觀察星形膠質細胞內A2AR表達升高與特定腦區(qū)的類淋巴系統(tǒng)關鍵分子AQP4的極性分布受損及胞外tau蛋白清除障礙的關系;最后，通過過表達人P301S位點突變tau蛋白及腦區(qū)特異性激活A2AR，探討A2AR對p-tau由海馬向前額葉皮質傳播的促

6、進作用，并通過western blot及免疫共沉淀手段分析其分子機制。
　　主要實驗結果及結論:
　　1.在中度創(chuàng)傷性腦損傷后24 h、7d及4w時間點檢測tau蛋白在Thr205、Ser262、Ser404等位點的磷酸化水平。通過與神經元標志物Neun共染，確定磷酸化tau蛋白的細胞定位。結果表明，TBI后tau蛋白磷酸化水平升高，主要位點為Ser404。傷后24 h在傷側皮層、海馬、丘腦及對側皮層、海馬、丘腦即出現(xiàn)tau

7、蛋白Ser404位點磷酸化水平升高。傷后7d，磷酸化tau蛋白水平在傷側皮層、丘腦及對側皮層、海馬仍繼續(xù)升高。此外，前額葉皮質也開始出現(xiàn)磷酸化tau蛋白的堆積。傷后4w，磷酸化tau蛋白主要位于傷側丘腦及對側海馬、前額葉皮質。過度磷酸化tau蛋白主要位于神經元內。淀粉樣肽前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)及高爾基染色的結果表明，TBI后tau蛋白磷酸化水平升高與神經元軸突、樹突損傷關系密切。行為學結果

8、顯示TBI后空間記憶功能受損，其中空間參考記憶傷后7d損傷顯著，傷后4w恢復至與sham組無顯著差異;空間工作記憶功能傷后7d及4w均低于sham組。以上結果提示TBI后tau蛋白Ser404位點磷酸化水平立即升高并持續(xù)至傷后4w，p-tau升高的腦區(qū)包括傷側及對側頂葉皮質、海馬、前額葉皮質、丘腦等空間記憶環(huán)路中的多個關鍵腦區(qū)，p-tau堆積區(qū)存在神經元損傷樹突與軸突損傷，空間記憶功能障礙的出現(xiàn)時間與p-tau升高及神經元損傷相符。以上

9、現(xiàn)象可能是導致TBI后慢性期空間記憶功能障礙迅速出現(xiàn)的重要原因。
　　2.在動物整體及細胞水平，通過藥理學（A2AR特異性拮抗劑ZM241385、非特異性拮抗劑咖啡因）及基因敲除手段探討A2AR調控TBI后tau蛋白磷酸化水平的分子機制以及抑制A2AR對空間記憶的保護作用。結果表明A2AR調控神經元內p-tau水平的機制包括:(1)通過激活PKA進而易化GSK-3β對tau蛋白Ser404位點的磷酸化作用;(2)敲除A2AR可以直

10、接導致GSK-3β抑制性磷酸化位點Ser9磷酸化水平的升高，降低tau蛋白磷酸化水平。高爾基染色結果表明TBI后4 w對側海馬齒狀回樹突棘密度減少，與學習記憶功能關系密切的細長形及蘑菇形樹突棘密度降低，失能的短粗形樹突棘比例升高，抑制A2AR可以顯著改善以上神經元樹突損傷。A2AR基因敲除可以改善TBI后小鼠空間參考記憶及空間工作記憶損傷。慢性口服咖啡因可以得到更好的保護空間工作記憶的效果。因此，以上結果表明TBI可通過促進神經環(huán)路相關

11、腦區(qū)A2AR的活化導致tau蛋白磷酸化水平升高，這也可能為tau蛋白病變傳播提供了必需的“種子”。
　　3.研究表明類淋巴系統(tǒng)對細胞外液溶質的清除需要依賴AQP4在血管周圍的極性分布介導的腦脊液及間隙液“集流”，AQP4的極性分布與反應性星形膠質細胞增生關系密切。我們通過檢測A2AR的表達水平、及GFAP與AQP4共染，發(fā)現(xiàn)TBI后對側海馬A2AR表達持續(xù)升高至傷后4w，其中3d達到高峰。傷后7d，升高的A2AR位于神經元及星形膠

12、質細胞中。傷后4w，神經元內A2AR水平降低，星形膠質細胞中A2AR表達水平仍較高。TBI引起對側海馬CA1區(qū)星形膠質細胞增生顯著，AQP4失去血管周圍的極性分布而移動到胞體及粗大的星形膠質細胞突起內。磷酸化tau蛋白水平也隨之升高。并伴隨出現(xiàn)對側海馬CA1區(qū)放射層及多形層樹突棘密度減少，短粗形樹突棘比例增高，蘑菇形及瘦長形樹突棘比例降低。敲除A2AR可以顯著改善TBI后慢性期反應性星形膠質細胞增生、AQP4極性紊亂、磷酸化tau蛋白堆

13、積及樹突棘形態(tài)異常等神經病理改變。以上結果表明TBI后星形膠質細胞內A2AR水平升高與特定腦區(qū)AQP4極性紊亂、細胞外p-tau清除障及神經元損傷有關。
　　4.通過在非腦損傷小鼠海馬過表達人P301S突變tau蛋白，或在輕度TBI模型中傷后7d開始連續(xù)7天在損傷對側海馬齒狀回注射A2AR激動劑CGS21680，檢測海馬及前額葉皮質內tau蛋白磷酸化水平改變。結果顯示海馬過表達P301Stau蛋白可引起注射區(qū)周圍神經元及同側、對側

14、前額葉皮質等海馬神經纖維投射區(qū)神經元胞體內p-tau(Ser404)含量升高。輕度TBI模型中，注射CGS21680激活A2AR可以引起注射位置tau蛋白磷酸化水平顯著升高，同時在兩側前額葉皮質內也可以觀察到磷酸化水平升高的tau蛋白，并顯著高于假手術組及TBI+vehicle組。以上結果表明p-tau沿神經投射跨腦區(qū)傳播可能是TBI后p-tau出現(xiàn)在未直接受損的PFC區(qū)的原因。通過免疫熒光方法檢測調控微管解聚的關鍵分子——驅動蛋白重鏈

15、2A(kinesin heavy chainmember2A，KIF2A)發(fā)現(xiàn)TBI后傷側半球KIF2A顯著升高，傷后7d對側海馬也檢測到KIF2A含量升高。進而通過免疫共沉淀檢測轉位因子相關蛋白(translin-associatedprotein X，TRAX)及KIF2A與A2AR的蛋白質相互作用，發(fā)現(xiàn)TBI后A2AR對p-tau跨腦區(qū)傳播的促進作用可能通過TRAX-KIF2A信號實現(xiàn)。
　　綜上，我們的研究表明TBI一方面

16、通過激活對側海馬A2AR信號通過PKA/GSK-3β途徑促進細胞內tau蛋白磷酸化水平升高，產生了tau蛋白傳播的“種子”;另一方面也可能通過TRAX/KIF2A這一非經典途徑促進過度磷酸化tau蛋白由對側海馬傳播至對側前額葉皮質，導致TBI后多個腦區(qū)p-tau含量升高，進而導致空間記憶功能障礙的早期出現(xiàn)。此外，星形膠質細胞的A2AR可能通過引起AQP4分布極性紊亂，導致星形膠質細胞水流介導的物質清除功能障礙，胞外tau蛋白的堆積，成為