sPLA2-ⅡA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能影響及機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作為一種全身彌漫性的病理狀態(tài),是大多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)。炎性反應(yīng)細(xì)胞及其釋放的產(chǎn)物已被認(rèn)為是最主要的促動(dòng)脈粥樣硬化因素。近年來,越來越多的證據(jù)表明,ⅡA類分泌型磷脂酶A2(secretoryphospholipase A2 groupⅡA,sPLA2-ⅡA)作為一個(gè)重要的炎性反應(yīng)介質(zhì),在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用。目前關(guān)于sPLA2-ⅡA的

2、研究多集中在對(duì)巨噬細(xì)胞的影響以及與脂代謝的關(guān)系上,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的研究較少。而內(nèi)皮功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的最初環(huán)節(jié),明確sPLA2-ⅡA的致炎效應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響,探索其發(fā)揮作用的機(jī)制,有助于進(jìn)一步了解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,并有助于探索動(dòng)脈粥樣硬化過程中的治療新靶點(diǎn)。
　　 研究目的：
　　 1.通過測(cè)定與分析多種內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子和分泌因子的表達(dá)水平,包括細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhe

3、sion molecule—1,ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)、一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase,eNOS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)和內(nèi)皮素-1(endothelin,ET—1),從不同角度了解sPLA2-ⅡA刺激對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。
　　 2.通過觀察4-BPB(4-bromophennacyl

4、bromide,sPLA2-ⅡA水解作用的抑制劑)對(duì)sPLA2-ⅡA誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能影響的變化,以了解sPLA2-ⅡA的水解作用是否參與了損傷內(nèi)皮細(xì)胞的過程。
　　 3.通過觀察PD98059(ERK選擇性抑制劑)、SP600125(JNK選擇性抑制劑)、SB203580(p38選擇性抑制劑)對(duì)sPLA2-ⅡA誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能影響的變化,以了解MAPKinase信號(hào)通路是否參與了sPLA2-ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　 4.

5、通過觀察Bay11-7085(NF—kB選擇性抑制劑)對(duì)sPLA2-ⅡA誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能影響的變化,以了解NF—kB是否參與了sPLA2-ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　 研究方法:
　　 1.體外分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)。
　　 2.不同濃度的sPLA2-ⅡA體外刺激HUVEC細(xì)胞,設(shè)置3個(gè)濃度(0.01、0.1、1μg/ml

6、),以未加任何藥物刺激培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照,以10ng/ml TNF—α刺激培養(yǎng)的細(xì)胞作為陽性對(duì)照,利用試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞上清的一氧化氮濃度,并利用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)方法分析一氧化氮合酶(eNOS)、內(nèi)皮素-1(endothelin,ET-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管粘附分子-1(VCAM—1)的mRNA表達(dá)水平的變化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VC

7、AM-1在蛋白水平的表達(dá)水平變化,用ELISA方法分析ET—1在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 3.采用體外分離培養(yǎng)HUVEC的方法,以1μg/mL sPLA2-ⅡA、10μ mol/L4-BPB單獨(dú)或聯(lián)合刺激內(nèi)皮細(xì)胞,利用試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞上清的一氧化氮濃度,并通過Real-Time PCR檢測(cè)分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1轉(zhuǎn)錄水平的變化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-I在蛋

8、白水平的表達(dá)變化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 4.以1μg/ml sPLA2-ⅡA、1μmol/LPD98059或SP600125或SB203580單獨(dú)或聯(lián)合刺激內(nèi)皮細(xì)胞,利用試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞上清的一氧化氮濃度,并通過Real-Time PCR檢測(cè)分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1轉(zhuǎn)錄水平的變化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表達(dá)變

9、化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 5.以1μg/ml sPLA2-ⅡA、1μmol/LBay11-7085單獨(dú)或聯(lián)合刺激內(nèi)皮細(xì)胞,利用試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞上清的一氧化氮濃度,并通過Real-Time PCR檢測(cè)分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1轉(zhuǎn)錄水平的變化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表達(dá)變化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的

10、表達(dá)變化。
　　 6.用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,組間比較用單因素方差分析(one-wayANOvA)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多重比較采用LSD和SNK法。p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.0.1μ g/ml和1μ g/ml的sPLA2-ⅡA均能誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1mRNA和蛋白水平的表達(dá)(p<0.05),且誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性(p<0.05)。
　　

11、 2.0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μ g/ml的sPLA2-ⅡA均能誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ET-1mRNA和蛋白的表達(dá),并且誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性(p<0.05)。1μ g/ml sPLA2-ⅡA能明顯抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)(p<0.01),各濃度的sPLA2-ⅡA對(duì)eNOS蛋白表達(dá)的影響不明顯；0.01μ g/ml、0.1μg/ml和1μg/ml的sPLA2-ⅡA均能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成(p<0.01)

12、,且呈濃度依賴性(p<0.05)。
　　 3.4-BPB干預(yù)組細(xì)胞的ICAM-1、VCAM-1 mRNA和蛋白的表達(dá)較1μg/ml sPLA2-ⅡA單獨(dú)刺激組顯著降低(p<0.01,p<0.05)。4-BPB處理明顯減弱1μg/ml sPLA2—ⅡA調(diào)節(jié)的ET—1 mRNA和蛋白的表達(dá)(p<0.01)；4-BPB處理也明顯減弱1μg/mlsPLA2-ⅡA調(diào)節(jié)的eNOS mRNA的表達(dá)(p<0.05),減弱sPLA2-ⅡA對(duì)NO生

13、產(chǎn)的抑制作用(p<0.01)。
　　 4.PD98059干預(yù)組細(xì)胞的ICAM-1、VCAM-1、ET-1蛋白的表達(dá)水平較1μg/mlsPLA2-ⅡA單獨(dú)刺激組顯著降低(p<0.01),PD98059處理也明顯減弱1μg/mlsPLA2-ⅡA抑制NO生成的作用(p<0.01)。
　　 5.SP600125干預(yù)組細(xì)胞的ET—1蛋白的表達(dá)水平較1μg/ml sPLA2-ⅡA單獨(dú)刺激組顯著降低(p<0.01),SP600125處

14、理也明顯減弱1μg/ml sPLA2-ⅡA抑制NO生成的作用(p<0.01)；但SP600125對(duì)1μg/ml sPLA2-ⅡA誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)增加的影響不顯著(P>0.05)。
　　 6.SB203580對(duì)1μg/ml sPLA2-ⅡA誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1、ET—1蛋白表達(dá)增加的影響不顯著(P>0.05),對(duì)1μg/ml sPLA2-ⅡA抑制NO生成的影響也不顯著(P>0.05)。
　　

15、 7.Bay11-7085干預(yù)組細(xì)胞的ICAM-1、VCAM-1、ET-1蛋白的表達(dá)水平較1μg/mlsPLA2-ⅡA單獨(dú)刺激組顯著降低(ICAM-1:p<0.01；VCAM-1:p<0.05；ET-1:p<0.01),但Bay11-7085對(duì)1μg/ml sPLA2-ⅡA抑制NO生成的影響不明顯(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.sPLA2-ⅡA能劑量依賴性地影響內(nèi)皮細(xì)胞功能,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子和ET-1的表