DNA剪切修復(fù)對MPTP-MPP+致帕金森病模型DNA氧化損傷的作用研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是僅次于是阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征為黑質(zhì)致密部大量多巴胺能神經(jīng)元變性或丟失。研究顯示，PD病人黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)DNA氧化損傷嚴(yán)重，若不被及時(shí)有效的修復(fù)，則可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。在多種DNA修復(fù)機(jī)制中，最主要和最重要的是DNA剪切修復(fù)，它可以分為堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)和核苷酸切除修復(fù)(nucleotide exci

2、sion repair，NER)。BER和NER分別依賴于多種蛋白的相互作用，其中，8-氧基-鳥嘌玲DNA糖苷酶(8-oxoguanosine DNA glycosylase，OGG1)是BER的限速因子；而著色性干皮病蛋白A、B、F、G(xeroderma pigmentosumfactor A，B，F(xiàn)，G，XPA，XPB，XPF，XPG)是NER不可或缺的蛋白因子；細(xì)胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear

3、 antigen，PCNA)是BER和NER共同需要的蛋白因子；以上蛋白的表達(dá)變化分別反映了細(xì)胞內(nèi)BER和NER的修復(fù)活性變化。
　　然而，在PD等神經(jīng)退行性疾病病理情況下，DNA氧化損傷與DNA剪切修復(fù)的關(guān)系及其相關(guān)蛋白表達(dá)變化卻仍未知。為探討DNA氧化損傷與DNA剪切修復(fù)在PD病理機(jī)制中的作用，本論文在Mpp+(1-methyl-4-phenyl-pyridinium)致PC12細(xì)胞的PD細(xì)胞模型上采用相差顯微技術(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)

4、觀察了細(xì)胞的形態(tài)和活力變化，并采用Hochest染色觀察細(xì)胞的凋亡情況，隨后采用Western-blot技術(shù)檢測了BER相關(guān)蛋白OGG1和NER相關(guān)蛋白XRA、XPB、XPF、XPG以及BER和NER共同的蛋白因子PCNA的表達(dá)變化，最后用8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine(8-oxodG)免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)研究了DNA氧化損傷情況；在MPTP(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-t

5、etrahydropyridine)致C57BL/6小鼠的PD動物模型上研究了黑質(zhì)內(nèi)BER和NER相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果概述如下：
　　1.PC12細(xì)胞的形態(tài)和活力變化
　　相差顯微技術(shù)的結(jié)果顯示，MPP+處理不同時(shí)間對PC12細(xì)胞的形態(tài)影響不大，但是處理24h后，細(xì)胞貼壁能力降低；而MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPP+處理PC12細(xì)胞18h和24h后，細(xì)胞活力顯著下降，分別降至78.6％和70.8％。
　　2.

6、PC12細(xì)胞的凋亡情況研究
　　我們進(jìn)一步用Hochest染色來觀察細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，MPP+處理PC12細(xì)胞18h后，有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，24h后凋亡現(xiàn)象進(jìn)一步發(fā)展，但是凋亡細(xì)胞增加并不顯著，提示MPP+氧化損傷并不顯著增加凋亡細(xì)胞的數(shù)目。
　　3.PC12細(xì)胞的BER和NER相關(guān)蛋白的表達(dá)變化
　　以上結(jié)果提示，Mpp+氧化損傷對細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞的凋亡影響不大，但卻時(shí)程依賴性地使細(xì)胞活力顯著降低，這可能與細(xì)胞內(nèi)應(yīng)

7、對損傷的DNA修復(fù)能力降低相關(guān)；已知MPP+是特異地介導(dǎo)細(xì)胞DNA氧化損傷的物質(zhì)，而細(xì)胞應(yīng)對DNA氧化損傷的修復(fù)機(jī)制主要是DNA剪切修復(fù)，因此，我們采用Western-blot技術(shù)結(jié)合光密度分析的方法檢測了MPP+處理不同時(shí)間后，PC12細(xì)胞內(nèi)BER和NER相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。光密度分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，BER限速因子OGG1的表達(dá)水平在處理1h后即顯著升高，比對照升高5.0倍；3h后達(dá)到高峰，升高6.4倍；之后依次下降，24h低于對照。

8、與之對應(yīng)的是，NER的各相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化顯著，XPA、XPB、XPF、XPG和PCNA在MPP+處理1h后即顯著上調(diào)，分別增加4.2倍、2.0倍、2.0倍、2.7倍和1.9倍；隨著MPP+處理時(shí)間的延長，各因子的表達(dá)量繼續(xù)上調(diào)，其中XPA和PCNA分別在12h和3h達(dá)到高峰，分別增加3.4倍和2.5倍，而XPB、XPF和XPG均在18h到達(dá)高峰，分別增加3.4倍、3.9倍和3.9倍；24h后，各蛋白表達(dá)水平均下降，其中PCNA顯著低

9、于對照。
　　4.PC12細(xì)胞的DNA氧化損傷情況研究
　　以上結(jié)果提示，MPP+氧化損傷能上調(diào)BER和NER相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，提示細(xì)胞內(nèi)DNA剪切修復(fù)能應(yīng)對DNA氧化損傷，但隨著MPP+處理時(shí)間的延長，BER和NER的修復(fù)能力均下降，且細(xì)胞活力下降顯著，這可能與DNA氧化損傷嚴(yán)重有關(guān)，因此我們進(jìn)一步用8-oxodG免疫細(xì)胞化學(xué)染色來觀察細(xì)胞的DNA氧化損傷。結(jié)果顯示，對照細(xì)胞的8-oxodG免疫陽性細(xì)胞主要分布于線粒體，

10、含量低；18h后，同時(shí)分布于線粒體和核，含量增多；24h后，主要集中在細(xì)胞核，含量最多，損傷最嚴(yán)重。結(jié)果提示，MPP+氧化損傷引起PC12細(xì)胞的DNA氧化損傷程度加劇，隨著處理時(shí)間的延長，氧化損傷的標(biāo)志性產(chǎn)物8-oxodG的分布，從線粒體逐步過渡到細(xì)胞核。推測細(xì)胞內(nèi)BER和NER蛋白表達(dá)水平下降進(jìn)而導(dǎo)致DNA剪切修復(fù)能力降低的原因是DNA氧化損傷加劇。
　　5.C57BL/6小鼠黑質(zhì)內(nèi)BER和NER相關(guān)蛋白的表達(dá)變化以上結(jié)果提示，

11、在PD細(xì)胞模型上，隨著DNA氧化損傷程度的改變，細(xì)胞內(nèi)DNA剪切修復(fù)(BER和NER)相關(guān)蛋白表達(dá)變化顯著，DNA氧化損傷加劇導(dǎo)致細(xì)胞BER和NER相關(guān)蛋白表達(dá)下降，DNA剪切修復(fù)能力降低。為了進(jìn)一步探討DNA氧化損傷加劇與DNA剪切修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化之間的關(guān)系，我們首先采用Western-blot結(jié)合光密度分析的方法檢測了MPTP腹腔注射C57BL/6小鼠3d后黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxy

12、lase，TH)的表達(dá)，結(jié)果顯示TH表達(dá)顯著下降，與對照相比降低63％。隨后檢測了BER和NER相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。光密度分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，OGG1和PCNA表達(dá)水平降低不明顯，但XPA、XPB和XPG均顯著下降，與對照相比，分別降低47％、58％和68％：此外，正常情況下黑質(zhì)內(nèi)(SN)的BER和NER相關(guān)蛋白表達(dá)的基線水平也差異顯著，OGG1比對照(中腦除黑質(zhì)以外的其他部位，SN-)低16倍，而XPA、XPB和XPG比SN-高1倍。

13、以上結(jié)果提示，正常情況下黑質(zhì)內(nèi)BER功能低下而NER相對要高；當(dāng)DNA氧化損傷加劇導(dǎo)致NER能力降低，可能是PD發(fā)病的原因之一。
　　小結(jié)：
　　1)在PD的細(xì)胞模型上，MPP+氧化損傷對PC12細(xì)胞的形態(tài)和凋亡情況影響不大，但顯著降低細(xì)胞活力。隨著MPP+處理時(shí)間延長，細(xì)胞DNA氧化損傷加劇。
　　2)在PD的細(xì)胞模型上，隨DNA氧化損傷程度的增加，PC12細(xì)胞BER和NER相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)水平變化顯著；DNA氧化

14、損傷加劇導(dǎo)致BER和NER相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降。
　　3)在PD的動物模型上，MPTP氧化損傷導(dǎo)致C57BL/6小鼠黑質(zhì)的NER相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著下降。
　　結(jié)論及意義：
　　在PD的細(xì)胞和動物模型上，NER相關(guān)蛋白表達(dá)水平隨DNA氧化損傷程度的加劇而顯著下降。結(jié)果提示，DNA氧化損傷加劇引起DNA剪切修復(fù)能力尤其是NER修復(fù)能力下降，加重了神經(jīng)元的損傷并導(dǎo)致其死亡，這可能是PD發(fā)病機(jī)制之一。該研究可能為闡明PD病理