胃粘膜特異性表達PAK4-Wntl雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、目的:
　　 胃癌是世界上第二大癌癥死因,其發(fā)生和發(fā)展是一個多基因、多因素、多階段的復(fù)雜過程,涉及多條信號傳導(dǎo)通路激活與失活。已有研究顯示胃癌與細胞周期調(diào)控因子、NF-κB、COX-2/PGE2以及Ras/MAPK、JNK/MAPK、Wnt/β-catenin、TGF-β、BMP、Notch等多條信號通路調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)。
　　 而近年來發(fā)現(xiàn),作為Ⅱ類PAK(p21-activatedkinase,PAK)代表性成員-P

2、AK4可與上述多種信號通路發(fā)生對話,調(diào)節(jié)下游各種底物的活性或重要的靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,在細胞的生長、生存、凋亡、增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著十分重要的作用,且其過度表達和基因突變廣泛存在于多種腫瘤中,其中也包括胃癌。目前PAK4已被確認為潛在的腫瘤治療新靶點,然而其與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制仍不是很清楚。
　　 此外,最新研究表明,胃癌也與Wnt信號通路密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號通路主要調(diào)控細胞的分化、增殖,其異常激活或調(diào)節(jié)蛋

3、白的功能改變可導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生,尤其與腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān),并且在30%的胃癌中存在該通路的激活。目前,已有轉(zhuǎn)基因或敲除小鼠模型證明該通路在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用,同時HirokoOshima等利用Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠也證明該通路在胃粘膜的單獨激活可導(dǎo)致胃癌前病變的發(fā)生,而與PGE2炎癥通路的同時激活則可導(dǎo)致胃腺腫瘤的發(fā)生,這也說明Wnt通路在胃癌中的作用可能是通過與其他信號通路協(xié)同發(fā)揮的。
　　 而研究顯示PAK4與

4、Wnt/β-catenin通路之間存在密切對話,兩者之間不但可以相互調(diào)控,而且可受某種蛋白或信號通路(如Ras、PI3K/Akt等)的共同調(diào)控,甚至還可共同調(diào)控下游某些腫瘤相關(guān)基因,如CyclinD1、c-myc等的轉(zhuǎn)錄,從而可能協(xié)同地促進胃癌的發(fā)生。因此,本研究通過建立在胃粘膜上皮特異性表達PAK4/Wnt1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,在生物活體內(nèi)進一步探究PAK4與wnt信號通路之間是否存在對話,并深入研究兩者在胃癌病變過程中的作用機制,為以

5、后篩選新型選擇性或雙靶點抗腫瘤藥物提供重要的理論依據(jù)和模式生物。
　　 方法:
　　 一、構(gòu)建在胃粘膜特異性表達轉(zhuǎn)基因載體
　　 以pCMV-3×flag-PAK4(NE)載體為模板,設(shè)計引物通過PCR擴增出帶有flag標(biāo)簽的PAK4(雙位點突變激活型)基因全長,同時引入BamHI單酶切位點,克隆到pMD19-T載體,并測序證實序列的正確性;然后用BamHI分別酶切pBluescript-K19-Wnt1載體(用

6、K19-Wnt1表示)和pMD19-PAK4連接產(chǎn)物,經(jīng)過去磷酸化處理、回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定以及測序,從而成功構(gòu)建了pBlucscript-K19-PAK4(用K19-PAK4表示)表達質(zhì)粒。
　　 二、在體外鑒定轉(zhuǎn)基因PAK4與Wnt1的表達
　　 將K19-Wnt1和K19-PAK4表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細胞,應(yīng)用WesternBlot方法檢測轉(zhuǎn)基因載體中目的基因在體外細胞水平的表達情況。
　　 三、轉(zhuǎn)基因小鼠的

7、產(chǎn)生
　　 (一)顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠
　　 將K19-Wnt1和K19-PAK4質(zhì)粒經(jīng)PineI單酶切,分別用QIAquidkGelExtractionKit試劑盒純化4.7Kb和5.3Kb目的片段,應(yīng)用顯微雙注射法將外源目的基因?qū)胧芫言酥?并將注射后的受精卵移植到同期受孕的假孕母鼠輸卵管中,預(yù)期在新生小鼠中可分別獲得K19-Wnt1、K19-PAK4以及K19-Wnt1/K19-PAK4(用K19-PAK4/

8、Wnt1表示)三個轉(zhuǎn)基因小鼠品系。
　　 (二)轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
　　 提取新生小鼠鼠尾基因組DNA,進行PCR方法鑒定,并應(yīng)用WesternBlot方法分析PAK4與Wnt信號通路中β-catenin基因在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠各組織中的表達情況以及Real-timePCR方法分析PAK4與Wnt1基因在胃組織的轉(zhuǎn)錄水平,同時篩選出在胃組織特異性高表達的品系。
　　 結(jié)果:
　　 一、構(gòu)建在胃粘膜特異性表達轉(zhuǎn)基

9、因載體
　　 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、測序分析等均與預(yù)期相符,說明成功構(gòu)建了K19-PAK4轉(zhuǎn)基因載體。
　　 二、在體外鑒定轉(zhuǎn)基因PAK4與Wnt1的表達
　　 與轉(zhuǎn)空載體的對照細胞相比,轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因載體的胃癌細胞SGC7901、BCG823中,K19啟動子能夠特異性啟動PAK4和Wnt1的表達。
　　 三、轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生
　　 (一)顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠
　　 將K19-Wnt1、K19

10、-PAK4酶切后的目的片段顯微雙注射301枚供體鼠(BDF1)的受精卵,并用234枚注射過的受精卵移植于8只ICR受體小鼠的輸卵管中,經(jīng)鼠尾基因組DNAPCR鑒定,得到3只FO代K19-PAK4/Wnt1雙轉(zhuǎn)基因小鼠,編號為11#、15#、43#;另外再將K19-Wnt1、K19-PAK4酶切后的目的片段分別顯微注射277枚、169枚受精卵,并將兩者注射成功的260枚、157枚受精卵分別移植于14只、8只ICR受體小鼠的輸卵管中,經(jīng)PC

11、R鑒定,分別得到4只F0代K19-Wnt1、2只F0代PAK4轉(zhuǎn)基因小鼠,編號分別為3#、22#、28#、53#和20#、57#。
　　 (二)轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
　　 將轉(zhuǎn)基因小鼠F0代與C57BL/6野生型小鼠回交,分別產(chǎn)生各系的F1代小鼠。將F1代陽性小鼠與C57BL/6野生型小鼠回交,共產(chǎn)生77只F2代小鼠,其中雌鼠33只,雄鼠44只,陽性率為44.16%,符合孟德爾遺傳定律。通過對F1代雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和同窩野生

12、型小鼠的胃體、胃竇、小腸、肝臟、胰腺、肺臟、腎臟、心臟以及腦組織進行WesternBlot檢測,發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,雙轉(zhuǎn)基因小鼠中PAK4在胃組織的表達和活性明顯增高,而β-catcnin的活性也顯著增高;同時,Real-timePCR方法分析得到轉(zhuǎn)基因陽性鼠胃組織中PAK4和Wntl基因的mRNA水平較正常鼠也明顯增高。此外,通過WesternBlot檢測篩選出雙轉(zhuǎn)基因小鼠中兩個高表達品系(F0-11#和F0-43#)。