急性T淋巴細(xì)胞白血病患者PCR-SSCP檢測(cè)Notch1基因突變及與LIM蛋白FHL1C相關(guān)性研究.pdf

1、白血病是一類(lèi)特殊的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病原因是因?yàn)橐职┗虮皇Щ?，致癌基因的激活，單?dú)或共同作用從而使細(xì)胞出現(xiàn)非正常的增殖現(xiàn)象與分化障礙，或凋亡機(jī)制受到干擾所引起。T-cell acute lymphoblastic leukemia即 T淋巴細(xì)胞急性白血病（T-ALL)是白血病里一種高侵襲性惡性腫瘤，特征以T細(xì)胞克隆增生、聚集及浸潤(rùn)組織為特征，其起源于T淋巴細(xì)胞的初期發(fā)育階段，屬于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其病程為進(jìn)行性，該疾病在兒童中的發(fā)

2、病率遠(yuǎn)高于成人。目前，聯(lián)合化療仍是該種疾病的首選治療途徑，但治療后患者再次出現(xiàn)發(fā)病的比例超過(guò)50％，平均生存時(shí)間（Mean survival time）短于1年，達(dá)到EFS(Event-free survival，無(wú)事件生存)標(biāo)準(zhǔn)的比例在異基因造血干細(xì)胞移植后僅為30%～50%，對(duì)于成人患者來(lái)說(shuō)，T-ALL療效尤為不佳，急需治療措施的進(jìn)步。因此，對(duì)T-ALL這一惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制、治療手段的深入研究和探索對(duì)于改善T-ALL患者的預(yù)后，提

3、高長(zhǎng)期生存率具有重要意義。
　　最先在人類(lèi)T-ALL中發(fā)現(xiàn)了Notch信號(hào)通路可影響到惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制，近年來(lái)相關(guān)研究顯示約50％T-ALL患者可存在Notc h1基因的突變，No tc h1基因已成為急性T淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制中最為常見(jiàn)的活躍癌基因。有資料顯示，T-ALL發(fā)生及發(fā)展的主要機(jī)制是人類(lèi)基因組中7號(hào)染色體上和9號(hào)染色體上的基因發(fā)生了易位（分別是TCR基因和No tc h1基因），No tc h基因組序列出現(xiàn)點(diǎn)突變后可

4、引起Notc h信號(hào)非正常激活。還有證據(jù)顯示，因染色體易位或點(diǎn)突變現(xiàn)象發(fā)生在Notc h基因均可導(dǎo)致 Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)組成部分內(nèi)重要的胞內(nèi)受體段(Notch intracellular domain，NIC)可呈現(xiàn)出不間斷的不依靠配體而出現(xiàn)活化的相關(guān)現(xiàn)象，這一異常機(jī)制可引起超過(guò)50%的T-ALL患者細(xì)胞內(nèi)Notc h1信號(hào)通路出現(xiàn)異?；罨F(xiàn)象。
　　在哺乳動(dòng)物的 Notch信號(hào)通路中，起轉(zhuǎn)錄激活作用的 RBP-J蛋白是以

5、轉(zhuǎn)錄因子的形式發(fā)揮生理功能的，其功能屬于DNA結(jié)合蛋白。Aster研究組發(fā)現(xiàn)RBP-J作為Notch信號(hào)通路其中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是作為與No tc h1突變異構(gòu)體主要的互相結(jié)合蛋白，形成復(fù)合物后可調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游里與T-ALL發(fā)生可能相關(guān)的一系列基因的表達(dá)。
　　在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種LIM結(jié)構(gòu)域蛋白KyoT2，可與NIC競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RBP-J而抑制RBP-J介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，已知屬于FHL1家族的FHL1C是人類(lèi)體內(nèi)的小鼠KyoT2分子同源

6、蛋白。近年來(lái)通過(guò)免疫組化分析和microarray譜比較臨床患者中提取的腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn) FHL1在如惡性腦腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中都呈現(xiàn)低表達(dá)，而在T-ALL患者中FHL1C（FHL1的選擇性剪切體亞型之一）呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。本研究組既往的研究成果證實(shí)FHL1C亦可抑制RBP-J介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄，其具體原理是上述現(xiàn)象抑制了與T-ALL發(fā)生有密切關(guān)系的 Notch信號(hào)通路下游C-Myc、HES1和HES5分子

7、的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)相關(guān)凋亡基因的表達(dá)。上述資料提示：對(duì)T-ALL患者同時(shí)檢測(cè)Notch1和FHL1C的基因突變情況有助于快速診斷T-ALL患者的病情狀況和預(yù)測(cè)其預(yù)后發(fā)展?；隍?yàn)證此設(shè)想，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。
　　主要研究結(jié)果：
　　1、通過(guò)收集T-ALL患者和對(duì)照組的骨髓及靜脈血樣本，分離骨髓及靜脈血淋巴細(xì)胞并提取其全基因組，設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR和巢式PCR（nes ted PCR）技術(shù)克隆出相關(guān)片段。按照要求構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組

8、，并用SSCP技術(shù)對(duì)Notch1和FHL1C可能發(fā)生突變位點(diǎn)位置的系列片段進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)比測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其檢驗(yàn)效率達(dá)到95%以上。
　　2、在此結(jié)果基礎(chǔ)上通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別分析了Notch1、FHL1C有效突變結(jié)果對(duì)患者的病情造成的影響，證實(shí)Notch1有效突變對(duì)T-ALL患者的預(yù)后影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)HL1C有效突變對(duì)患者預(yù)后影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但二者存在交互作用，提示FHL1C有效突變可影響Notch1有效突變對(duì)T-ALL患者的

9、預(yù)后作用。
　　3、成功構(gòu)建了表達(dá)FHL1C的真核表達(dá)載體FHL1C-pEGFP-N1，通過(guò)核酸轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞、Wester n-blot驗(yàn)證表達(dá)蛋白、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)產(chǎn)生的熒光蛋白，證明了所構(gòu)建的真核表達(dá)載體的正確性，為進(jìn)一步研究FHL1C分子兩端區(qū)域的不同功能做好了前期準(zhǔn)備工作。
　　以上研究結(jié)果顯示，通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)對(duì)T-ALL患者基因突變位點(diǎn)進(jìn)行診斷，相比較傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)，在同樣保持準(zhǔn)確率的基礎(chǔ)上還具有簡(jiǎn)便快速