與LIM蛋白FHL1C相互作用蛋白的檢測.pdf

1、目前，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在中國都呈增加趨勢，據(jù)統(tǒng)計資料顯示惡性腫瘤已成為中國城市居民死因的第一位。因此，惡性腫瘤的預防和治療已成為現(xiàn)階段研究的焦點。惡性腫瘤不僅生長迅速，而且能夠發(fā)生局部侵潤，遷移蔓延到身體的其他部位，這是惡性腫瘤最重要的生物學特點。它不僅是導致患者死亡的主要原因也是癌癥治療中的最大障礙，因此目前的研究主要集中在其發(fā)生發(fā)展的機制，以尋求治療癌癥的突破點。
　　EMT（Epithelial-Mesenchyma

2、l Transition，EMT）作為腫瘤侵襲與轉移的重要參與者，使細胞之間的連接與腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生了新的聯(lián)系。EMT過程中細胞間的緊密連接出現(xiàn)了功能障礙，細胞與細胞之間的粘附和細胞的極性喪失，細胞的遷移和侵襲能力增強，這與腫瘤的轉移過程機制相同。EMT的發(fā)生涉及多種信號途徑的相互作用，其中Notch信號通路是誘導EMT發(fā)生的主要信號途徑之一。Notch∕RBP-Jk信號途徑是進化上高度保守的一條信號通路途徑，通過介導相鄰細胞間的相互作用

3、而與多種生理及病理過程密切相關，其異?；罨c多種腫瘤的發(fā)生密切相關。多項研究結果表明Notch信號途徑的活化可以促進EMT過程的發(fā)生，而且下調Notch信號途徑則可引發(fā)相反的過程，并抑制細胞的遷移和侵襲能力，但其具體作用機制尚不清楚。RBP-Jk是Notch信號途徑中最主要的下游效應物，Notch信號途徑的活化是依賴于RBP-Jk介導的轉錄激活下游基因而實現(xiàn)的。在對Notch信號途徑的研究中發(fā)現(xiàn)LIM結構域蛋白KyoT2（鼠源）可以與R

4、BP-Jk相互作用形成復合物，進而競爭性抑制RBP-Jk介導的Notch下游基因的轉錄，阻斷Notch的活化。
　　FHL1C，KyoT2人的同源物，是FHL1蛋白的一種亞型，屬于LIM蛋白家族中的LIM-only蛋白。它包含氨基端的兩個半LIM結構域和和羧基端的RBP-Jk結合位點。含有LIM結構域的蛋白不僅在不同的細胞進程中具有重要的作用，比如細胞骨架組織，信號傳導，基因表達和細胞分化等，而且是一個蛋白間相互作用的基序。這種相

5、互作用能夠顯示不同的功能，從而在細胞組織結構的維持以及信號通路等中發(fā)揮作用。研究組前期通過在對KyoT2抑制RBP-Jk介導的轉錄機制的深入研究過程中，以KyoT2為誘餌蛋白通過酵母雙雜交實驗得到了人類緊密連接蛋白ZO-2，并初步驗證了KyoT2與 ZO-2的相互作用位點。本實驗首先通過哺乳動物雙雜交實驗驗證 ZO-2與KyoT2在體內的是否有相互作用，后又以FHL1C為目的蛋白通過免疫沉淀實驗在FHL1C和RBP-Jk共轉組中拉下了人

6、類緊密連接蛋白ZO-1。ZO-1和ZO-2屬同一蛋白家族，在上皮和內皮細胞間的連接中具有重要的作用。并且在EMT發(fā)生的過程中，ZO-1和ZO-2都為重要的參與者，但是它們參與的過程是通過何種機制發(fā)生的，目前尚不清楚。因此基于以上研究結果分析，通過與FHL1C（鼠源的KyoT2）相互作用蛋白的檢測結果，推測ZO-1可能通過Notch信號途徑而參與EMT的發(fā)生過程。目前，共進行了如下實驗。
　　主要研究結果：
　　1.分三段成功

7、克隆了小鼠緊密連接蛋白ZO-2開放讀碼框全長基因，并將其連入哺乳動物雙雜交系統(tǒng)質粒pCMX-VP16中，分別構建了分段和全長的pCMX-VP16-F1R1,pCMX-VP16-F2R2,pCMX-VP16F3R3和pCMX-VP16-ZO的真核表達質粒。
　　2.為了證實KyoT2和緊密連接蛋白ZO-2之間在體內是否存在相互作用及確定其作用位點，在Cos7細胞系中進行了KyoT2與ZO-2之間分段以及全長的哺乳動物雙雜交實驗，結果

8、分析表明它們未能激活下游的報告基因的活性，即KyoT2和ZO-2在體內可能沒有相互作用關系。
　　通過實驗結果分析，原因可能為：1.酵母雙雜交試驗有一定的假陽性結果。2.在體外通過GST-pull-down驗證的蛋白質之間的相互作用在體內不一定有作用。但是LIM結構域是蛋白質間相互作用的界面，我們設想KyoT2在通過其RBP-Jk結合位點競爭性抑制NIC的轉錄激活作用外，還可能通過其LIM結構域向RBP-Jk募集其它轉錄調控分子。

9、因此想要通過FHL1C進一步尋找與其相互作用的新蛋白以期更明確的闡明阻斷Notch信號途徑的作用機理并為設計優(yōu)化新型的Notch信號阻斷劑奠定理論基礎。因此接下來又進行了如下實驗：
　　主要研究成果
　　1.通過在293T細胞系中瞬時轉染真核表達載體pCMV-myc-FHL1C48小時后，用Western-blot成功檢測到帶myc標簽的過表達蛋白FHL1C。
　　2.通過免疫沉淀，銀染色確定有相互作用的新蛋白，并在質

10、譜分析結果中在FHL1C和RBP-Jk共轉組中成功發(fā)現(xiàn)了拉下的新的相互作用蛋白人類緊密連接蛋白ZO-1。
　　綜合以上結果分析，ZO-1和ZO-2同屬于緊密連接蛋白家族，且ZO-1和ZO-2之間通過相互結合共同定位在上皮細胞的緊密連接處的質膜內，并且已有研究表明ZO-1和ZO-2都為上皮間充質轉化 EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）發(fā)生的相關分子，ZO-1從質膜向胞質的異位和功能失