利用體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建先天性腎病綜合征克隆豬模型.pdf

1、目的：
　　先天性腎病綜合征（Congenital Nephrotic Syndrome，CNS）（芬蘭型）的特點(diǎn)為：罹患者在出生后約3個(gè)月內(nèi)表現(xiàn)出典型腎病綜合征的表現(xiàn)。大多數(shù)情況下，罹患該病的兒童在宮內(nèi)期間即存在癥狀，表現(xiàn)為新生兒低體重，可以在很短的時(shí)間內(nèi)迅速惡化至腎小球硬化階段，傳統(tǒng)的激素及免疫抑制治療無(wú)效，大多患者在出生后6個(gè)月左右因嚴(yán)重并發(fā)癥而死亡。該病的致病基因是NPHS1（位于人類(lèi)19號(hào)染色體長(zhǎng)臂13.1位置）。實(shí)驗(yàn)用

2、小型豬作為一種與人類(lèi)在病理及病生上高度近似的動(dòng)物，具有很高的疾病建模價(jià)值。類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALENs）作為多類(lèi)物種當(dāng)中通用的基因敲除技術(shù)，可以對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行精確基因修飾?！绑w細(xì)胞核移植技術(shù)”（somatic-cell-nuclear transfer，SCNT）是指：將哺乳動(dòng)物的“早期胚胎細(xì)胞（early embryonic

3、 cells）”亦或“體細(xì)胞”胞核人工移進(jìn)“去核后（denucleate）”的受精卵或卵母細(xì)胞中，最終娩出的子代個(gè)體的基因型和供體細(xì)胞相同，這個(gè)過(guò)程又稱(chēng)為“克?。–lone）”或無(wú)性繁殖（asexual reproduction）。本實(shí)驗(yàn)我們利用由 TALENs技術(shù)所獲得的基因修飾細(xì)胞（NPHS1雙等位基因敲除豬胎成纖維細(xì)胞）充當(dāng)克隆的供體核來(lái)源，借助SCNT創(chuàng)制NPHS1—/—先天性腎病綜合征克隆豬，為今后相關(guān)研究提供疾病動(dòng)物模型。<

4、br>　　方法：
　　1)采用“金門(mén)法（Golden Gate）”構(gòu)建針對(duì)NPHS1外顯子2（exon2）的TALENs載體，再用“電擊核轉(zhuǎn)染法”將TALEN質(zhì)粒及抗性篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小型豬原代成纖維細(xì)胞（Porcine primary fibroblasts，PPF）得到NPHS1—/—細(xì)胞。
　　2)以此NPHS1基因修飾豬胎成纖維細(xì)胞作為供體（復(fù)蘇后培養(yǎng)并懸液化），配合豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程。
　　3)采用“盲吸法（

5、Blind Aspiration method）”，棄除卵的胞核，分批卵周隙注射 NPHS1—/—細(xì)胞。
　　4)利用“電脈沖-刺激法（electric pulse stimulation）”，將上一步得到的“重構(gòu)胚”進(jìn)行融合操作。
　　5)體視鏡下觀察檢查，判斷供體細(xì)胞是否已與卵母細(xì)胞有效融合，挑棄未融合的重構(gòu)胚并統(tǒng)計(jì)融合率（胚胎融合的同時(shí)即激活）。
　　6)進(jìn)行短期體外胚胎培養(yǎng)（In vitro embryocul

6、ture），手術(shù)方法將胚胎移植進(jìn)代孕受體母豬。
　　7)維持代孕母豬115±2天的妊娠，期間超聲判斷受孕情況。
　　8)克隆仔豬娩出后組織取材，提出仔豬基因組，利用PCR-測(cè)序方法鑒定陽(yáng)性克隆仔豬。
　　結(jié)果：
　　1)TALEN打靶后篩選得到NPHS1—/—細(xì)胞。
　　2)分批卵周隙注射N(xiāo)PHS1—/—細(xì)胞，每批重構(gòu)胚均融合良好。
　　3)選取部分陸續(xù)做手術(shù)胚胎移植，累計(jì)移植代孕受體母豬5頭，成功移

7、入胚胎分別為470、460、410、380、370枚，且30d超聲診斷其中懷孕3頭，統(tǒng)計(jì)受孕率達(dá)60％。
　　4)其中2頭孕受體在約孕90d左右發(fā)生胚胎退化吸收，另1頭于孕117d產(chǎn)下1頭克隆仔豬。克隆仔豬身長(zhǎng)、體量均與自然豬相仿，體溫也波動(dòng)在同類(lèi)正常范圍內(nèi)、覓乳正常，活動(dòng)能力與同類(lèi)相仿，表現(xiàn)出了較好地外界適應(yīng)能力。
　　5)克隆仔豬取材組織并提取基因組PCR-測(cè)序方法鑒定為野生型（wild type，WT）。
　　結(jié)

8、論：
　　筆者采用TALENs基因打靶和電擊核轉(zhuǎn)染技術(shù)（Electric nuclear transfection）成功篩選獲得NPHS1”雙等位基因敲除”P(pán)PF，證實(shí)由TALEN敲除的豬胎成纖維細(xì)胞能夠較好地經(jīng)受體外篩選的壓力。筆者挑選NPHS1基因敲除供體細(xì)胞成功注射到去核卵母細(xì)胞的卵周隙，重構(gòu)胚胎融合/激活后獲得了較高的融合率，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中所采用的相關(guān)方法及參數(shù)具有可行性，能夠得到穩(wěn)定的克隆結(jié)果；也證實(shí)了TALEN得到的基

9、因修飾細(xì)胞經(jīng)歷體外篩選壓力，完全能夠滿意地作為核移植的供體細(xì)胞來(lái)源。筆者成功利用胚胎移植手術(shù)，代孕受體母豬前期受孕率達(dá)到了60%的水平，“NPHS1打靶克隆”胚胎移植與“自然克隆”的前期受孕率處在同一水平，證明本實(shí)驗(yàn)所采用的核移植技術(shù)路線及操作參數(shù)具有可行性。也證實(shí)TALEN打靶的PPF細(xì)胞充當(dāng)核移植供體細(xì)胞，具備充分的“重編程（reprogramming）”能力而獲得較高的受孕率。本實(shí)驗(yàn)雖然獲得了克隆豬，經(jīng)鑒定只獲得了WT野生型，此次