飾膠蛋白聚糖對(duì)大鼠系膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其泛素化調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、前言：
　　飾膠蛋白聚糖(decorin,DCN)是一種可由腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC)分泌、富含亮氨酸的蛋白聚糖,在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成、組成等方面都發(fā)揮重要的作用。DCN的過表達(dá)可抑制體外培養(yǎng)MC的生長(zhǎng)及其TGF-β1蛋白的合成,并可影響其TIMP-2mRNA的表達(dá)和Ⅳ型膠原的合成,因此,DCN是一個(gè)很有前景的防治腎小球。腎炎及阻止腎小球硬化的

2、細(xì)胞因子。近年來研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),DCN還可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),并有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,其機(jī)制可能與EGFR蛋白表達(dá)的下調(diào)及p21蛋白表達(dá)的上調(diào)相關(guān)。但DCN的這一作用,在非腫瘤細(xì)胞中的報(bào)道不盡相同,盡管近年有研究發(fā)現(xiàn)DCN能夠上調(diào)P21的表達(dá),但其對(duì)非腫瘤細(xì)胞是否具有抑生長(zhǎng)、促凋亡作用,以及是否與EGFR表達(dá)下調(diào)有關(guān)等問題仍存在分歧。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中,已證實(shí)過表達(dá)DCN可抑制體外培養(yǎng)MC的生長(zhǎng),但有關(guān)DCN能否促進(jìn)MC凋亡以

3、及其抑制MC生長(zhǎng)是否通過EGFR表達(dá)改變,目前尚不清楚。
　　由于DCN具有重要的生物學(xué)效應(yīng),尤其在拮抗腎小球腎炎MC增生和ECM合成過程中起重要作用,故在實(shí)驗(yàn)中如何增加DCN的穩(wěn)定性,并增強(qiáng)其生物活性,被視為對(duì)DCN進(jìn)行深入研究的重點(diǎn)。近年來,一些學(xué)者在對(duì)DCN蛋白活性調(diào)節(jié)的研究中,發(fā)現(xiàn)DCN的降解代謝可能經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)介導(dǎo),有學(xué)者在對(duì)卵巢腫瘤的研究中,應(yīng)

4、用蛋白酶體抑制劑MG132處理后,發(fā)現(xiàn)該腫瘤細(xì)胞的DCN蛋白總量升高,提示DCN的降解可能是通過泛素化調(diào)節(jié)的。UPP是一個(gè)參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解過程,并影響細(xì)胞生理功能的重要系統(tǒng),已有許多研究表明,其對(duì)很多種細(xì)胞的生理活動(dòng)起重要調(diào)節(jié)作用。但至今,仍沒有直接證據(jù)表明DCN在細(xì)胞內(nèi)是通過UPP而發(fā)生降解及其影響因素。因此,明確MC內(nèi)DCN降解與UPP的關(guān)系,并探索通過調(diào)控該途徑可否達(dá)到增強(qiáng)或減弱DCN蛋白的活性、繼而影響腎MC活動(dòng)的目的,是本

5、課題研究的一個(gè)重要出發(fā)點(diǎn)。
　　有研究表明,UPP是一個(gè)可逆的過程,即細(xì)胞內(nèi)還同時(shí)存在一些特異性的去泛素化蛋白酶,后者能阻礙靶蛋白的降解而對(duì)其形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)。泛素特異性修飾酶2-69(ubiquitin-specific processing protease 2-69,USP2-69)為泛素特異性修飾酶家族(iubiquitin-specific processing proteases,USPs)中的一個(gè)重要成員,不僅已被證實(shí)

6、在腎組織內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá),而且還是一個(gè)與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的去泛素化酶。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),USP2-69表達(dá)上調(diào)與腎小球腎炎病變中MC增生有一定的相關(guān)性,而DCN對(duì)MC的生長(zhǎng)有抑制作用,因此,我們?cè)O(shè)想U(xiǎn)SP2-69有可能是一種與DCN表達(dá)密切相關(guān)的去泛素化酶,可能依賴其對(duì)蛋白降解水平的調(diào)節(jié)而影響DCN的穩(wěn)定性及活性。
　　因此,本課題采用基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾和免疫共沉淀等技術(shù),觀察:DCN對(duì)MC生長(zhǎng)和凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制;明確M

7、C內(nèi)DCN的降解途徑及其影響因素,以及調(diào)控該途徑對(duì)DCN功能的影響;觀察MC內(nèi)USP2-69和DCN的結(jié)合及定位,以及USP2-69對(duì)DCN的泛素化和細(xì)胞內(nèi)DCN蛋白水平的影響,以期為治療以系膜增生為特征的腎小球疾病尋找新的作用靶點(diǎn)而提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分DCN對(duì)大鼠腎MC生長(zhǎng)及凋亡的影響
　　目的：探討DCN對(duì)大鼠腎MC生長(zhǎng)及凋亡的影響及其可能機(jī)制。
　　方法：純化pcDNA3.1A-DCN真核表達(dá)質(zhì)粒及酶切鑒

8、定;將pcDNA3.1A-DCN質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC,并用DCNsiRNA雙鏈寡核糖核苷酸對(duì)其進(jìn)行干擾。再分別采用RT-PCR和Western blot方法,檢測(cè)DCN的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá);應(yīng)用流式細(xì)胞儀和Hoechst 33258染色法分別檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡;用Western blot方法,分別檢測(cè)活性caspase-3、EGFR、p21和TGF-β1的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：純化的pcDNA3.1A-DCN質(zhì)粒經(jīng)過EcoRI及Xba

9、I雙酶切后得到約5400bp大小的pcDNA3.1A條帶和1068bp大小的DCN目的基因條帶。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1A-DCN質(zhì)粒可上調(diào)MC內(nèi)DCN的mRNA和蛋白表達(dá);使G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯增多,S期的細(xì)胞數(shù)減少,提示MC生長(zhǎng)受到抑制,且p21蛋白表達(dá)升高,EGFR蛋白表達(dá)降低;同時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯升高,且活性caspase-3蛋白表達(dá)升高;TGF-β1的蛋白表達(dá)被明顯抑制。轉(zhuǎn)染DCNsiRNA可以下調(diào)MC內(nèi)DCN的蛋白表達(dá),使

10、G0/G1期的細(xì)胞數(shù)減少,S期的細(xì)胞數(shù)增多,且p21蛋白表達(dá)降低,EGFR蛋白表達(dá)升高;同時(shí)細(xì)胞凋亡率降低,且活性caspase-3降低;TGF-β1的蛋白表達(dá)明顯升高。
　　小結(jié)：經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)法成功獲得穩(wěn)定高表達(dá)DCN基因的MC株(D19)。DCN可以通過活化caspase-3參與調(diào)控MC的凋亡,并能通過對(duì)EGFR和p21蛋白表達(dá)的影響,參與調(diào)控MC的生長(zhǎng),且DCN可有效調(diào)節(jié)MC內(nèi)TGF-β1的蛋白表達(dá)。
　　第二部分泛素

11、-蛋白酶體途徑介導(dǎo)MC內(nèi)DCN的降解過程
　　目的：明確大鼠腎MC內(nèi)DCN的降解途徑以及調(diào)控該途徑對(duì)DCN功能的影響。
　　方法：應(yīng)用免疫共沉淀的方法在MC內(nèi)檢測(cè)DCN是否與泛素蛋白相結(jié)合;使用蛋白酶體抑制劑MG132或溶酶體抑制劑NH4Cl處理MC,應(yīng)用免疫共沉淀檢測(cè)泛素化DCN水平及Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCN蛋白總量;分別使用MG132和/或蛋白合成抑制劑cycloheximide(CHX)處理MC,用Ti

12、me-course western blot法檢測(cè)DCN半衰期;使用N-糖鏈抑制劑tunicamycin處理MC,應(yīng)用免疫共沉淀檢測(cè)泛素化DCN水平及Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCN蛋白總量;使用tunicamycin和/或CHX處理MC,用Time-course western blot檢測(cè)DCN半衰期;使用MG132或tunicamycin處理MC,用RT-PCR檢測(cè)DCN和ColⅣ的mRNA表達(dá),Western blot檢

13、測(cè)DCN和TGF-β1的蛋白表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　結(jié)果：MC內(nèi)DCN與泛素蛋白相結(jié)合,使用MG132可以顯著提高M(jìn)C內(nèi)DCN的泛素化水平和蛋白總量,而應(yīng)用NH4C1對(duì)DCN的泛素化水平和蛋白總量無明顯作用。使用CHX單獨(dú)處理的MC內(nèi)DCN的半衰期約為12h,聯(lián)合使用MG132后,DCN降解被阻斷,其半衰期明顯延長(zhǎng)。使用tunicamycin可以提高細(xì)胞內(nèi)DCN的泛素化水平,促進(jìn)DCN降解而降低DCN蛋白總量,以及使D

14、CN的半衰期明顯縮短,約為6h。經(jīng)MG132處理后,伴隨MC內(nèi)DCN蛋白表達(dá)升高,ColⅣ的mRNA表達(dá)降低,TGF-β1蛋白表達(dá)降低,同時(shí)G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯增多;而經(jīng)tunicamycin處理后,伴隨MC內(nèi)DCN蛋白表達(dá)降低,TGF-β1蛋白表達(dá)則顯著升高。
　　小結(jié)：大鼠腎MC內(nèi)DCN主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解,DCNN-糖鏈的合成抑制可促進(jìn)其泛素化和降解,調(diào)控DCN的泛素化降解可影響ColⅣ的mRNA表達(dá)、TGF-

15、β1的蛋白表達(dá)和MC生長(zhǎng)。
　　第三部分USP2-69對(duì)MC內(nèi)DCN泛素化降解過程的調(diào)節(jié)
　　目的：明確USP2-69對(duì)DCN泛素化降解過程的影響。
　　方法：采用Western blot法檢測(cè)大鼠MC、肝細(xì)胞株(BRL-3A)和足細(xì)胞(GEC)內(nèi)USP2-69的表達(dá);分別采用免疫共沉淀和激光共聚焦顯微鏡觀察方法,檢測(cè)MC內(nèi)USP2-69是否與DCN結(jié)合,并觀察兩者在細(xì)胞內(nèi)的定位;純化pRK5-USP2-69-HA真核

16、表達(dá)質(zhì)粒及酶切鑒定;將pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MC,應(yīng)用Western blot的方法,分別檢測(cè)HA、USP2-69和DCN的蛋白表達(dá),用免疫共沉淀的方法檢測(cè)MC內(nèi)DCN的泛素化水平。
　　結(jié)果：在MC內(nèi)USP2-69的蛋白表達(dá)高于BRL-3A和GEC。MC內(nèi)USP2-69可與DCN相互結(jié)合,且兩者在胞質(zhì)內(nèi)共定位。純化的pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ及HindⅢ雙酶切后得到約4600bp大小的p