ISP-1對(duì)大鼠肥大腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白影響的研究.pdf

1、目的：觀察高糖對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(glomerularmesangialcell，GMC)細(xì)胞大小及其細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成分分泌的變化，及其對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(CellCycleRegulatoryProteins，CCRP)表達(dá)及其細(xì)胞周期時(shí)相分布的影響。并探討從冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草菌絲中提取的具有免疫抑制活性的物質(zhì)--多球殼

2、菌素(myriocin，ISP-1)的干預(yù)效應(yīng)。 方法：參照Fujita及Kluepfel等方法，采用經(jīng)典的液相色譜法及有機(jī)溶劑反復(fù)萃取的方式，從人工冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草菌絲中提取ISP-1。利用體外培養(yǎng)大鼠GMC，予以高糖(450mg/dlD-glucose，HG)制造GMC細(xì)胞肥大模型，同時(shí)以正常糖(100mg/dlD-glucose，NG)組及高滲(350mg/dlD-mannitol+100mg/dlD-glucose，MN)組

3、作為對(duì)照，并以HG加ISP-1(450mg/dlD-glucose+100ug/mlISP-1，ISP-1)作為干預(yù)組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞大小(以前向角散射光平均強(qiáng)度表示細(xì)胞大小)、細(xì)胞周期分布及CyclinD1的表達(dá)。GMC中其它CCRP如p21cipl、P27kipl及CyclinE的表達(dá)采用Western印跡法檢測(cè)。以ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的纖維連接蛋白(FN)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、透明質(zhì)酸(

4、HA)及層粘連蛋白(LN)等ECM的含量，采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)GMC細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)。 結(jié)果：高糖組GMC細(xì)胞體積較正常糖組及高滲組明顯增大(P＜0.05)，而高滲組與正常糖組相比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，由此可知高糖可導(dǎo)致GMC肥大；正常糖組有一定的CyclinD1、CyclinE、p21cipl、P27kipl及α-SMA表達(dá)和ECM的分泌，而高糖組CCRP、α-SMA表達(dá)及ECM分泌明顯增加，且隨時(shí)間

5、的延長(zhǎng)更加明顯，72h達(dá)高峰。此外細(xì)胞周期分析提示高糖可使GMC停滯于G1期，高糖組G1期細(xì)胞比例較正常糖組明顯增高(P＜0.05)。而加入ISP-1后可以明顯改善GMC的肥大、細(xì)胞周期停滯和CCRP表達(dá)，同時(shí)可使ECM分泌和α-SMA的表達(dá)顯著減少。而ISP-1組的GMC細(xì)胞大小、CCRP和α-SMA的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌的表達(dá)與正常糖組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：高糖導(dǎo)致GMC發(fā)生雙向生長(zhǎng)反應(yīng)，即細(xì)胞先進(jìn)行

6、自限性增生，后便停止在G1末期發(fā)生肥大，并且導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)表達(dá)增加。CyclinD1和CyclinE表達(dá)增加導(dǎo)致GMC細(xì)胞增生，而p21cipl、P27kipl表達(dá)的上調(diào)在GMC細(xì)胞肥大和細(xì)胞周期停頓中起重要作用。同時(shí)高糖導(dǎo)致GMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，即α-SMA表達(dá)增高與腎纖維化密切相關(guān)。ISP-1可能通過(guò)改善CCRP、α-SMA的表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的異常分泌及細(xì)胞周期停滯，從而抑制GMC的肥大、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及ECM分泌。由此推測(cè)I