SIgMλ輕鏈在雞傳染性法氏囊病毒感染DT40細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、傳染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)是引起雞傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)的致病病原體,主要侵害雛雞中樞免疫器官-法氏囊,對(duì)B淋巴細(xì)胞造成損傷從而引起嚴(yán)重的免疫抑制。具有有表面免疫球蛋白M(surfaceimmunoglobulin M,SIgM)的B細(xì)胞是IBDV最易感的細(xì)胞。λ輕鏈不僅是B細(xì)胞輕鏈的主要類型,同時(shí)參與SIgM的形成,

2、但其在IBDV感染過(guò)程中的作用并不清楚。為了揭示SIgMλ輕鏈在IBDV感染雞法氏囊前B淋巴細(xì)胞DT40過(guò)程中的作用,本研究在分析B細(xì)胞λ輕鏈的序列后,從DT40細(xì)胞中克隆了λ輕鏈基因。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-λ并在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的λ輕鏈蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印PVDF(polyvinylidene fluoride)膜后,利用病毒覆蓋蛋白印跡技術(shù)(Virus overlay

3、 protein blot assay,VOPBA)鑒定λ輕鏈與IBDV的結(jié)合。
　　為構(gòu)建靶向DT40細(xì)胞SIgMλ輕鏈基因的基因打靶載體,轉(zhuǎn)化DT40細(xì)胞建立SIgMλ輕鏈缺失的細(xì)胞模型,進(jìn)一步探究λ輕鏈功能,本研究從雞DT40細(xì)胞中克隆β-actin啟動(dòng)子,替換pCDNA3.1(+)載體中的SV40啟動(dòng)子,構(gòu)建β-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Neomycin抗性基因表達(dá)框。在對(duì)SIgMλ輕鏈基因進(jìn)行染色體定位后,克隆其基因座位兩側(cè)

4、各約2kb的側(cè)翼序列并將其分別插入到抗性表達(dá)框的兩側(cè)作為同源臂,構(gòu)建靶向SIgMλ輕鏈的基因打靶載體,并對(duì)打靶載體進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。VOPBA結(jié)果顯示λ輕鏈能夠與不同毒力的IBDV毒株特異結(jié)合,λ輕鏈在IBDV感染DT40細(xì)胞中起著結(jié)合病毒的作用,可能就是IBDV感染的受體。打靶載體的測(cè)序結(jié)果表明設(shè)計(jì)的載體序列正確符合要求,靶向SIgMλ輕鏈基因的打靶載體被成功構(gòu)建,這為轉(zhuǎn)化DT40細(xì)胞建立SIgMλ輕鏈基因敲除的細(xì)胞模型,深