宿主SRC調(diào)控雞傳染性喉氣管炎病毒感染的機制研究.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎（Avian infectious laryngotracheitis，AILT）是由雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）引發(fā)的一種雞的上呼吸道疾病，該病給養(yǎng)禽業(yè)國家造成嚴重的經(jīng)濟損失。其病原ILTV是一種皰疹病毒，在感染機體后造成潛伏感染從而逃避機體免疫監(jiān)視，導(dǎo)致目前基于激發(fā)宿主免疫應(yīng)答而產(chǎn)生防控效果的各類疫苗都難以長效地防控本病，因此探索防制AILT的

2、新策略至關(guān)重要。
　　研究ILTV與宿主間的相互作用尤其是ILTV在細胞間的傳播可為防制AILT提供新思路。前期研究表明，宿主SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）是ILTV感染細胞過程中主要的調(diào)節(jié)因子，但其具體調(diào)控機制尚不清楚。為此我們先用兩種小分子抑制劑PP1和PP2阻斷SRC，實時激光共聚焦成像顯示抑制SRC可促進ILTV在細胞間傳播，通過流式細胞術(shù)和高內(nèi)涵細胞篩選系統(tǒng)分別對SRC抑制后ILTV-EGFP感染的EGFP陽性細胞數(shù)和

3、EGFP熒光面積進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示兩者均顯著增多（p＜0.05），用RNA干擾的方法沉默SRC后也得到了相同的結(jié)果。病毒在細胞間傳播分為游離傳播和細胞-細胞間傳播兩種，為了深入了解抑制SRC促進ILTV在細胞間傳播的主導(dǎo)因素，我們通過qPCR和TCID50的方法檢測了SRC抑制后ILTV感染24 h內(nèi)細胞上清中的病毒載量與滴度，結(jié)果顯示ILTV含量極低且不存在顯著差異，而在細胞上清中加入ILTV中和抗體后對ILTV-EGFP感染24 h

4、內(nèi)的EGFP熒光面積進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示SRC抑制后EGFP熒光面積依然顯著增多(p＜0.05)，以上結(jié)果說明抑制SRC促進LLTV在細胞間傳播不依賴于病毒的游離傳播，但可能依賴于細胞-細胞間傳播，而后者包括病毒吸附、病毒進入和病毒在細胞-細胞間傳播三種情況，我們分別針對三種情況進行了檢測。流式細胞術(shù)結(jié)果表明，抑制SRC可促進ILTV進入細胞，但對ILTV吸附細胞沒有顯著影響。為了進一步了解ILTV在細胞-細胞間傳播的機制，我們設(shè)計了感染

5、細胞與未感染細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。高內(nèi)涵細胞篩選系統(tǒng)統(tǒng)計結(jié)果顯示，共培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)感染細胞增殖和細胞間胞質(zhì)直接聯(lián)系對抑制SRC促進ILTV在細胞間傳播這一過程影響均不顯著，抑制SRC促進ILTV在細胞間傳播主要由感染細胞內(nèi)SRC抑制而引發(fā)。為了進一步從分子水平闡述其中的機制，我們在抑制宿主SRC情況下對病毒感染24 h的全基因組轉(zhuǎn)錄譜進行測定，并結(jié)合生物信息學(xué)分析推測，抑制SRC促進ILTV在細胞間傳播與Akt信號通路和MAPK信號通路中的MEK

6、及p38通路有關(guān)。為了驗證我們的推測，我們分別在ILTV-EGFP感染前和感染后對三個信號通路都各自用了兩種小分子抑制劑進行阻斷，然后檢測在宿主SRC抑制情況下ILTV-EGFP在細胞間的傳播情況。結(jié)果表明，MEK信號通路阻斷后，抑制SRC依然促進ILTV-EGFP在細胞間傳播，而Akt和p38MAPK信號通路阻斷后，抑制SRC對ILTV-EGFP在細胞間傳播無顯著促進作用，這說明MEK信號通路并未參與SRC對ILTV在細胞間傳播的調(diào)控