SIgMλ輕鏈的基因沉默對IBDV結合DT40細胞的影響.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞的傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的傳染性免疫疾病。雞的法氏囊是該病毒侵染的靶器官，主要是膜表面可以表達SIgM的法氏囊前B淋巴細胞。研究表明，SIgMλ輕鏈是IBDV感染法氏囊細胞時的一個重要結合位點。但SIgMλ輕鏈基因在IBDV感染雞法氏囊細胞的過程中的分子機制還需要進一步的探究。
　　 為了深入研究SIgMλ輕鏈基因在IBDV感染雞法氏囊細胞中的基因功能，本研究利用RNAi技術設計了一個可

2、以特異性抑制SIgMλ輕鏈基因表達的表達載體pAnGH1—shCRL。將該載體轉(zhuǎn)染DF—1細胞和DT40細胞，利用流式細胞術和RT—PCR等技術鑒定了SIgMλ輕鏈基因的表達情況；并利用病毒感染實驗鑒定了IBDV感染表達pAnGH1—shCRL基因序列的DT40細胞的情況。
　　 為了構建可以在細胞內(nèi)特異性抑制SIgMλ輕鏈基因表達的RNAi載體，在分析了SIgMλ輕鏈的基因序列后，以pCDNA3．1(+)載體為骨架，將SV40

3、啟動子改變?yōu)殡u源的β—actin啟動子形成用于驅(qū)動新霉素抗性基因(Neomycin)表達；同時裝入增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因表達框以及用于啟動shRNA轉(zhuǎn)錄的H1啟動子，構建了一個具有EGFP綠色熒光標記和新霉素抗性，同時可以靶向干擾SIgMλ輕鏈基因表達的共表達載體pAnGH1—shCRL。該載體不僅可以用來標記和追蹤被轉(zhuǎn)染的陽性細胞，而且還可以用于持續(xù)轉(zhuǎn)錄shRNA的基因沉默穩(wěn)定細胞系的篩選。
　　 流式細胞術、RT

4、—PCR等結果顯示：同對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染pAnGH1—shCRL載體的DT40細胞與SIgMλ輕鏈的特異性單抗L1的結合明顯下降，SIgMλ輕鏈基因的表達受到抑制，并且該細胞與IBDV的結合率也明顯降低。這說明pAnGH1—shCRL表達載體可以在DT40細胞內(nèi)特異性的干擾SIgMλ輕鏈基因的表達。利用pAnGH1—shCRL表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DT40細胞，在G4．18抗性培養(yǎng)基中進行篩選并利用有限稀釋法挑取單克隆，對其進行擴大培養(yǎng)和功

5、能性鑒定，實驗結果顯示得到的單克隆細胞經(jīng)過多次的傳代后，pAnGH1—shCRL載體仍然能夠持續(xù)表達并對SIgMλ輕鏈基因的表達進行特異性的抑制。結果表明構建的pAnGH1—shCRL共表達載體的RNAi效果是高效的。
　　 本實驗利用RNAi技術成功獲得了SIgMλ輕鏈基因持續(xù)沉默的單克隆細胞株，通過實驗進一步證實了SIgMλ輕鏈是IBDV與DT40細胞的一個重要結合位點，SIgM九輕鏈基因的表達與否可以影響IBDV與DT40