犏牛及其親本IGF2、H19、SNRPN和DAZL等四個基因表達(dá)活性及其DNA甲基化修飾分析.pdf

1、牦牛是青藏高原及其毗鄰地區(qū)不可或缺的全能家畜，對高寒氣候等惡劣環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性，但其生產(chǎn)性能較低。為了提高牦牛的生產(chǎn)性能，我國從上世紀(jì)50年代開始采用良種黃牛與牦牛進(jìn)行雜交，雜種一代犏牛表現(xiàn)出很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，但其雄性不育使得雜種優(yōu)勢的利用受到了極大的限制，成為牦牛雜交改良的“攔路虎”.為了探討犏牛雄性不育問題，本研究以成年健康雄性犏牛、黃牛和牦牛為研究對象，運(yùn)用同源擴(kuò)增、PCR克隆測序方法獲得牦牛印記基因或精子發(fā)生相關(guān)基因差異甲基化區(qū)

2、(DMR)序列，利用Real-time PCR技術(shù)檢測了這些基因在犏牛及其親本睪丸組織中的表達(dá)差異，運(yùn)用亞硫酸氫鈉測序法檢測了相關(guān)基因DMR甲基化狀態(tài)，為研究犏牛雄性不育與DNA甲基化的關(guān)系提供理論基礎(chǔ). 1.牦牛H19/IGF2印記控制區(qū)(ICR)的分子克隆及序列分析 本實驗根據(jù)黃牛H19基因DNA序列NW_001494548設(shè)計引物擴(kuò)增出牦牛H19基因長約6.5 kb的序列(GenBank登錄號：EU502716)，

3、該序列包含完整的印記控制區(qū)(ICR)、啟動子和部分第一外顯子，用生物信息學(xué)方法，將該序列與黃牛、綿羊、豬、人類和小鼠的相應(yīng)序列比對分析，發(fā)現(xiàn)牦牛與他們的相似度分別為97％、83.13％、48％、47％，42％；該擴(kuò)增序列中共有6個CpG島，長度分別為1182、1186、707、277、281和1311 bp；有6個鋅指蛋白CTCF結(jié)合位點，均位于CpG島內(nèi)，分別定位于轉(zhuǎn)錄起始部位上游5.5 kb、5.1 kb、4.1 kb、3.7 kb

4、、2.7 kb和1.3 kb；H19基因5'端存在核心啟動子區(qū)，TATA box、GC box及Sp1、Sp2、AP2、NF-кB、STAT5、P53、WT1. GFI1、MTBP、CPBP、ZF9、E2F和Myc-Max等識別位點. 2.犏牛及其親本睪丸組織中H19基因mRNA表達(dá)水平、DNA甲基化狀態(tài)差異分析 本實驗運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)對犏牛及其親本睪丸組織中H19基因表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，犏牛

5、的表達(dá)水平極顯著高于黃牛和牦牛(P<0.01)，而黃牛和牦牛兩者之間表達(dá)差異不顯著(P>0.05). 采用亞硫酸氫鈉測序法檢測了包含CTCF結(jié)合位點3(CTCF-binding siteⅢ)的H19 ICR的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，犏牛H19 ICR的甲基化水平(48.82％)極顯著低于黃牛(70％)(P<0.01)，顯著低于牦牛(59.10％)(P<0.05)，但黃牛的甲基化水平顯著高于牦牛(P<0.05)；犏牛CTCF結(jié)合位點

6、3的甲基化水平(48.33％)極顯著低于黃牛(75％)和牦牛(68％)(P<0.01).說明H19 ICR及ICR中的CTCF結(jié)合位點對H19基因表達(dá)調(diào)節(jié)具有重要作用. 3.犏牛及其親本睪丸組織中IGF2基因mRNA表達(dá)水平、DNA甲基化狀態(tài)差異分析 本實驗根據(jù)黃牛IGF2基因組序列DQ298740設(shè)計引物擴(kuò)增出了牦牛IGF2基因第十外顯子部分序列，GenBank登陸號為FJ152104；通過Real-time PCR檢

7、測了犏牛及其親本睪丸組織中IGF2基因的表達(dá)水平，運(yùn)用亞硫酸氫鈉測序法檢測了睪丸組織中IGF2基因第十外顯子DMR的甲基化狀態(tài).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，犏牛睪丸組織中IGF2基因mRNA表達(dá)水平最低，與親本的表達(dá)水平差異極顯著(P<0.01)；黃牛、牦牛和犏牛睪丸中IGF2 DMR的甲基化水平分別為90％、90.7％和92.0％，三組之間均未見顯著差異(P>0.05).實驗結(jié)果說明IGF2基因mRNA表達(dá)水平與牛精子發(fā)生有關(guān)，可能在牛的精子發(fā)生過程中

8、發(fā)揮重要作用，并可能與犏牛雄性不育有關(guān)；IGF2基因第十外顯子DMR區(qū)的甲基化與IGF2基因在犏牛及其雙親睪丸中的表達(dá)差異無關(guān)，可能是其他的機(jī)制參與調(diào)節(jié)IGF2基因的表達(dá). 4.犏牛及其親本睪丸組織中印記基因SNRPN的表達(dá)及DMR甲基化分析 本實驗根據(jù)黃牛SNRPN基因序列NW935049設(shè)計引物擴(kuò)增出了牦牛SNRPN基因5’端序列，長為1137 bp，與黃牛參照序列相似度達(dá)98.2％；經(jīng)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)含有YY1

9、和SP1等甲基化敏感位點.通過Real-time PCR檢測了犏牛及其親本睪丸組織中SNRPN基因的表達(dá)水平，運(yùn)用亞硫酸氫鈉測序法檢測了睪丸組織中SNRPN基因5’端DMR的甲基化狀態(tài).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織中SNRPN基因mRNA表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，但黃牛和牦牛SNRPN基因的表達(dá)高于犏牛；犏牛SNRPN DMR的甲基化水平(38.53％)極顯著高于黃牛(21.08％)和牦牛(20.81％)的(P<0.01).

10、說明犏牛SNRPN DMR區(qū)的高甲基化本身還不足以引起SNRPN基因表達(dá)水平的顯著變化，還有其它機(jī)制參與SNRPN基因的表達(dá)調(diào)節(jié). 5.DAZL基因5’端CpG島DNA甲基化水平及其與犏牛雄性不育的關(guān)系研 前期研究發(fā)現(xiàn)DAZL基因與犏牛雄性不育相關(guān)，是犏牛雄性不育的候選基因.為了進(jìn)一步研究調(diào)控DAZL基因表達(dá)的機(jī)制，本實驗根據(jù)黃牛DAZL基因序列(NC_007299，complement:141791034..14181

11、8671)設(shè)計引物擴(kuò)增了牦牛DAZL基因的5’端序列，并對牦牛，黃牛和犏牛DAZL基因的甲基化水平進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：牦牛DAZL基因的5’端存在CpG島，CpG島長1744bp(EU686694:650～2393)，包含啟動子區(qū)、第一外顯子和第一內(nèi)含子；犏牛DAZL5’端DNA甲基化水平(85.6％)極顯著高于黃牛(71.4％)和牦牛(69.8％)(P<0.01).可見犏牛DAZL基因的高甲基化與其mRNA表達(dá)缺乏、雄性不育的表型是