KLF5在AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞增殖中的作用及其機制研究.pdf

1、血管平滑肌細胞（VSMC）在血管損傷因素刺激下可發(fā)生表型轉換而獲得增殖能力。VSMC增殖是高血壓、動脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病的共同細胞病理學基礎。闡明VSMC增殖的發(fā)生機制，對防治血管重塑和逆轉增殖性血管病變具有重要的意義。
　　 血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）不僅具有調節(jié)血管舒縮功能的活性，而且在VSMC增殖中也發(fā)揮關鍵作用，AngⅡ通過與細胞膜上相應的AngⅡ受體結合而激活多條信號途徑，引發(fā)一系列細胞內信號級聯(lián)反應和

2、相關基因表達，進而調節(jié)VSMC表型和功能。研究AngⅡ調節(jié)促增殖基因的表達和促進VSMC增殖的作用機制，有助于闡明血管增殖性疾病發(fā)生的分子機制。
　　 為了闡明KLF5在AngⅡ調節(jié)cyclin D1基因表達及促進VSMC增殖中的作用，本文在系統(tǒng)觀察AngⅡ對VSMC增殖、遷移活性影響的基礎上，進一步探討了KLF5在介導AngⅡ促增殖中的作用和分子機制。旨在為揭示動脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機制提供新的實驗

3、和理論依據(jù)，為心血管疾病的防治提供特異性藥物靶點。
　　 1.AngⅡ對VSMC增殖和遷移的影響
　　 利用MTT、流式細胞術和Western blot分析等方法，觀察AngⅡ對VSMC增殖及遷移活性、細胞周期進程、分化和去分化標志基因表達的影響。結果如下：
　　 1.1 AngⅡ對VSMC生物學行為的影響
　　 MTT分析、流式細胞術和傷口愈合實驗結果顯示，不同濃度（10-8、10-7、10-6M）的A

4、ngⅡ處理細胞不同時間（3、6、12、24、48 h）后，可明顯增加VSMC增殖和遷移活性，而且具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性。
　　 1.2 AngⅡ對VSMC分化標志基因SM22α和增殖標志基因PCNA表達的影響
　　 結果顯示，在AngⅡ處理的細胞中，分化標志基因SM22αmRNA和蛋白的表達水平明顯降低，而增殖標志基因PCNA表達活性則顯著升高，具有明顯的時間和濃度依賴效應。結果提示，AngⅡ是VSMC的促增殖

5、因子。
　　 2.KLF5在AngⅡ誘導的cyclin D1表達及VSMC增殖中的作用
　　 眾多研究表明，轉錄因子KLF5是一個與細胞生長、增殖和凋亡調節(jié)密切相關的基因，在VSMC增殖及血管病變形成過程中起重要的調控作用。本部分研究觀察了AngⅡ誘導VSMC增殖過程中KLF5和cyclin D1的表達變化及二者之間的關系。
　　 2.1 AngⅡ對體外培養(yǎng)的VSMC cyclin D1和KLF5表達的影響

6、>　　 RT-PCR和Western blot結果表明，AngⅡ可顯著誘導KLF5和cyclin D1基因的轉錄和蛋白表達，并具有明顯的時-效（3、6、12、24、48 h）和量-效（10-8、10-7、10-6M）關系。細胞免疫化學分析顯示，在AngⅡ處理的VSMC中，KLF5陽性染色顆粒明顯增多，且主要分布在細胞核內。
　　 2.2 KLF5過表達對VSMC cyclin D1表達和VSMC增殖及遷移活性的影響
　　

7、 以KLF5腺病毒表達載體Ad-KLF5感染VSMC48 h，經(jīng)Western blot分析和細胞免疫化學染色證實，外源性KLF5在VSMC中高效表達。在Ad-KLF5感染的VSMC中，cyclin D1的表達活性也明顯升高，與KLF5的變化趨勢一致。在KLF5過表達的細胞中，PCNA的表達活性也同步升高，提示細胞處于高增殖活性。
　　 2.3 KLF5基因敲低對VSMC cyclin D1基因表達和VSMC增殖及遷移活性的影

8、響
　　 結果顯示，導入KLF5-siRNA后， KLF5基因和蛋白的表達活性降低約70％以上，表明該基因已被有效敲低。
　　 3.KLF5與c-Jun相互作用介導AngⅡ誘導的cyclin D1基因表達
　　 序列分析顯示，在cyclin D1基因啟動子區(qū)存在KLF5和AP-1結合位點。KLF5與AP-1均可能參與cyclin D1基因的轉錄激活調節(jié)。本部分研究探討這兩種轉錄因子在cyclin D1基因轉錄激活

9、過程中的作用及相互關系，進一步揭示AngⅡ誘導cyclin D1基因表達的調控機制。
　　 3.1 KLF5對cyclin D1啟動子指導的報告基因表達的影響
　　 熒光素酶活性分析結果顯示，KLF5可明顯促進cyclin D1啟動子的轉錄激活活性，而缺失了N端的激活結構域的KLF5C突變體不能激活cyclin D1啟動子報告基因的表達。
　　 3.2 AngⅡ誘導cyclin D1基因表達與促進KLF5與c-J

10、un相互作用有關
　　 ChIP分析結果顯示，用KLF5或c-Jun抗體分別沉淀AngⅡ處理細胞的染色體片段，從中均可以擴增得到cyclin D1基因啟動子區(qū)的2個KLF5（-868～-1094、-538～-801）和1個AP-1（-10～-245）的結合序列，但在未經(jīng)AngⅡ處理的細胞中不能檢測出上述DNA序列。表明KLF5和AP-1在反式激活cyclin D1基因轉錄過程中都發(fā)揮調控作用。
　　 3.3 KLF5與c

11、-Jun在體外相互作用
　　 GST pull-down結果顯示，細胞核蛋白中的KLF5可被GST-c-Jun融合蛋白淘選出來。而且，從AngⅡ刺激的VSMC核蛋白中，用GST-c-Jun親和得到的KLF5較對照組明顯增多。結果表明，AngⅡ可誘導c-Jun與KLF5在體內、外的相互作用。
　　 3.4 AP-1與KLF5協(xié)同激活cyclin D1基因表達
　　 將cyclin D1啟動子報告基因轉染COS-7細

12、胞，AngⅡ處理可誘導報告基因的表達活性；當與c-Jun或KLF5表達質粒共轉染時，AngⅡ誘導的報告基因表達活性有較大的升高；而c-Jun和KLF5表達質粒共轉染細胞時，報告基因的激活較單獨轉染組升高1倍左右。結果表明，AP-1與KLF5在AngⅡ誘導的cyclin D1基因表達中具有疊加作用。
　　 4.AngⅡ誘導VSMC增殖的信號轉導機制
　　 AngⅡ通過與VSMC上的相應受體相互作用而觸發(fā)細胞增殖信號的跨膜轉

13、導，最終引起細胞增殖相關基因表達及VSMC增殖。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)反應是轉導細胞增殖信號進入細胞核的一條重要信號轉導通路。本部分探討了AngⅡ對VSMCs中MAPK信號途徑的影響，以期闡明AngⅡ誘導KLF5活化和促進細胞增殖的信號調節(jié)機制。
　　 4.1 AngⅡ誘導VSMC中KLF5的磷酸化活化
　　 用磷酸化絲氨酸抗體和KLF5抗體進行交互沉淀來檢測磷酸化KLF5的水平。當AngⅡ作用VSMC0.5

14、 h時，磷酸化KLF5的水平開始升高，1 h時達到高峰，具有明顯的時-效關系。而在同樣條件下，KLF5總蛋白水平并無明顯改變。
　　 4.2 ERK1/2和p38MAPK通路介導AngⅡ誘導的KLF5磷酸化
　　 用特異性磷酸化抗體檢測MAPK通路中的三個主要成員，即ERK1/2，JNK，p38MAPK的磷酸化水平變化。結果顯示，當AngⅡ處理VSMC15 min時，ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平開始升高，到3

15、0 min時達到高峰，并維持在此水平至2 h時開始下降。但AngⅡ處理不影響JNK的磷酸化水平。
　　 結果提示，AngⅡ可通過激活ERK1/2和p38MAPK信號通路而誘導KLF5磷酸化活化，進而促進cyclin D1表達和VSMC增殖。
　　 4.3 ERK1/2和p38MAPK通路介導AngⅡ誘導的VSMC增殖和cyclin D1基因表達
　　 為了證明AngⅡ激活ERK1/2/MAPK和p38/MAPK通

16、路與其促VSMC增殖作用之間的關系，用特異性阻斷劑處理細胞后，檢測了AngⅡ誘導的VSMC增殖活性的變化。結果顯示，加入阻斷劑PD98059和SB203580后，均可降低AngⅡ的促VSMC增殖效應；細胞周期分析可見，AngⅡ可使G0/G1期細胞數(shù)目明顯減少，S期細胞明顯增加，細胞周期進程加快；而加入阻斷劑PD98059和SB203580后，AngⅡ誘導的細胞周期變化消失。結果提示，ERK1/2和p38MAPK參與介導了AngⅡ促VSM

17、C增殖的信號轉導。
　　 進一步的報告基因分析顯示，用ERK1/2和p38MAPK通路的特異性阻斷劑阻斷AngⅡ信號的胞內轉導后，AngⅡ誘導的cyclin D1啟動子-報告基因表達活性顯著降低。結果提示，ERK1/2和p38MAPK通路在AngⅡ誘導的cyclin D1表達中發(fā)揮重要作用。
　　 結論:
　　 1.AngⅡ誘導VSMC發(fā)生表型轉化，促進VSMC增殖和遷移。
　　 2.AngⅡ促VSMC增