上皮性卵巢癌的發(fā)生及早期診斷研究.pdf

1、[研究背景與目的]
　　 卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。由于缺乏有效的早期篩查手段,早期癥狀及臨床表現(xiàn)不典型,約85％的患者初診時已屬疾病晚期。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC),是卵巢癌中最常見類型,也是婦科腫瘤中死亡率最高的腫瘤類型,其死亡率高于其他所有婦科腫瘤之和。因為主要有早期篩查手段缺乏,早期診斷治療對于延長患者生存時間是非常重要的一個環(huán)節(jié),但是卵巢癌發(fā)生的分子生物學機

2、制仍是未解之謎,給卵巢腫瘤的早期診斷帶來困難和挑戰(zhàn)。上皮性卵巢癌中又以卵巢高分化漿液性乳頭狀癌是常見的病理類型,普遍認為這種類型有部分起源于卵巢表面上皮細胞。然而,到目前為止,還沒有任何直接實驗證據(jù)證明卵巢表面上皮細胞能夠形成高分化漿液性乳頭狀癌。研究表明,人卵巢惡性腫瘤的組織學類型分化是受多種因素影響的,包括上皮細胞一系列基因型和表現(xiàn)型的改變,可歸納為多種因素共同產(chǎn)生的生物學現(xiàn)象。探索卵巢癌的發(fā)生機制具有深遠的理論和現(xiàn)實意義。

3、　　 HER2/neu基因是一種原癌基因,位于17號染色體長臂上,編碼185 KD跨膜蛋白,具有酪氨酸激酶活性,屬于人類表皮生長因子受體家族。以往對于HER2/neu基因的研究,主要集中于對乳腺癌的診斷、預(yù)后及靶向治療的效果,而在上皮性卵巢癌中研究較少。研究表明,HER2/neu基因擴增及蛋白的過度表達與卵巢癌的預(yù)后及治療有密切聯(lián)系。25-30％的乳腺癌和卵巢癌中發(fā)現(xiàn)HER2/neu基因擴增及蛋白的過度表達,并被認為是與預(yù)后不良相關(guān)的

4、因素,HER2/neu基因通過多種機制參與卵巢癌的演進,HER2/neu蛋白高表達與卵巢癌的多種臨床特征相關(guān),如臨床分期較晚、手術(shù)中發(fā)現(xiàn)巨大腫塊幾率高、病理學分化差、較高復(fù)發(fā)率、生存時間短和對以鉑類藥為主的化療不敏感。
　　 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生向成纖維細胞或間充質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力。其主要特征為上皮表型缺失和間質(zhì)表型獲

5、得。EMT在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移以及多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要的作用,研究發(fā)現(xiàn),上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細胞發(fā)生分子轉(zhuǎn)換,失去上皮特性而獲得間質(zhì)特性,繼而具備運動性以掙脫細胞間黏附,并侵犯到其他部位的過程。此外,腫瘤微環(huán)境通過特異因子的作用影響著腫瘤細胞的生物學特性。
　　 為了探討HER2/neu基因過表達對卵巢上皮性腫瘤(Epithelial ovarian cancer,EOC)形成的作用,以及基因作用對上皮性卵巢癌生成的意

6、義；進一步揭示腫瘤發(fā)生過程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)以及腫瘤細胞生長微環(huán)境(Tumor Microenvironment)的影響。本文進行了以下幾個方面的研究:1.建立遺傳背景明確的過表達HER2/neu基因的T29Nt、T80Nt卵巢癌細胞模型。2.建立實驗動物模型,揭示遺傳成分與腹膜腔微環(huán)境共同誘導(dǎo)作用對正常人類卵巢表面上皮向卵巢惡性腫瘤轉(zhuǎn)化過程的影響。3.觀察并

7、檢測腫瘤生物學特性,為更多的卵巢腫瘤研究建立可靠穩(wěn)定的腫瘤細胞模型,為臨床卵巢惡性腫瘤的早期診斷提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 [研究目的]
　　 構(gòu)建表達HER2/neu基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒,將逆轉(zhuǎn)錄病毒感染兩個永生化的人卵巢上皮腫瘤前細胞系T29、T80,經(jīng)過藥物篩選獲得穩(wěn)定過表達HER2/neu基因的T29N、T80N永生化細胞系。觀察穩(wěn)定過表達HER2/neu基因的T29N、T80N細胞株形態(tài)特征,并通過軟瓊脂實驗檢

8、測細胞進行活體外探測評價和定量分析細胞純系化集落生長的潛力和生物學特性。
　　 [研究方法]
　　 1.將帶有HER2/neu基因的pBabe-HER2/neu-neomycin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Phoenixamphotropic包裝細胞,獲得帶有目的基因的重組載體病毒上清。
　　 2.用帶HER2/neu基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染兩個永生化的人類卵巢表面上皮腫瘤前細胞系T29和T80,T29和T80為本實驗室通過將SV40

9、T/t抗原和hTERT轉(zhuǎn)染至人類卵巢表皮細胞系IOSE29和IOSE80中而獲得的永生化細胞系。感染細胞恢復(fù)后經(jīng)新霉素篩選,分別得到穩(wěn)定過表達HER2/neu基因的T29N和T80N兩個永生化細胞系。
　　 3.倒置顯微鏡下觀察T29、T80、T29N、T80N活細胞形態(tài)特征,并比較不同細胞系之間、子代細胞系與親代細胞系之間的細胞表型差異。
　　 4.采用Western-blot印跡蛋白檢測技術(shù),驗證HER2/neu蛋白

10、在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后細胞系T29N、T80N與親代細胞及對照細胞間表達的差異。
　　 5.應(yīng)用軟瓊脂實驗方法,取同代T29、T80、T29N、T80N細胞進行實驗,進行活體外探測評價和定量分析細胞純系化集落生長的潛力。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.帶有HER2/neu基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞,產(chǎn)生病毒上清感染T29、T80細胞系,獲得T29N、T80N
　　 經(jīng)過pBabe-HER2/neu-neomyc

11、in質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Phoenix amphotropic包裝細胞,培養(yǎng)產(chǎn)病毒細胞系,獲得帶有HER2/neu基因的病毒上清。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo),將HER2/neu基因?qū)氲絋29和T80中,用新霉素篩選獲得含建立HER2/neu cDNA的純化系,分別命名為T29N和T80N細胞系。
　　 2.親代細胞與T29N、T80N細胞的形態(tài)學特征
　　 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)活細胞形態(tài)分別為:T29細胞與親本細胞IOSE29一樣具有

12、間質(zhì)細胞形態(tài)學特征,細胞呈現(xiàn):細胞間隙略大,稍稍分離,細胞成短梭形類似成纖維細胞的間質(zhì)細胞形態(tài)。而T80細胞與親本細胞IOSE80一樣具有上皮細胞形態(tài)學特征,顯微鏡下觀察,細胞呈現(xiàn):細胞核圓形或橢圓形,位于細胞中央或稍偏位,染色質(zhì)細致均勻,為較典型的上皮細胞形態(tài)。T29N和T80N細胞都呈現(xiàn)上皮樣細胞形態(tài),細胞核圓形或橢圓形,位于細胞中央或稍偏位,染色質(zhì)增粗不均勻。
　　 3.T29N和T80N細胞系中HER2/neu蛋白表達<

13、br>　　 通過Western-blot蛋白印跡檢測,以HER2/neu蛋白高表達的卵巢癌細胞SKOV3為對照,T29和T80細胞系為HER2/neu低表達,T29N和T80N細胞系獲得穩(wěn)定HER2/neu蛋白過表達。其中β-actin為內(nèi)參照,比較加樣總蛋白的量。
　　 4.體外細胞形成集落能力的差異
　　 取同代的過表達HER2/neu基因的T29N和T80N細胞與T29、T80細胞進行軟瓊脂實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達H

14、ER2/neu的T29N、T80N細胞株比T29、T80細胞具有更強的集落形成能力,生成的集落數(shù)約為3倍。
　　 [結(jié)論]
　　 1.成功構(gòu)建帶有HER2/neu基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒,并通過病毒感染獲得穩(wěn)定過表達HER2/neu的T29N、T80N永生化細胞株。
　　 2.T29N細胞呈現(xiàn)間質(zhì)細胞形態(tài),T80N細胞為上皮細胞形態(tài)。
　　 3.過表達HER2/neu的T29N、T80N株純系化細胞比T29、T8

15、0細胞具有更強的集落形成能力。
　　 [研究目的]
　　 分別將T29、T80、T29N、T80N細胞接種到裸鼠的皮下及腹膜腔內(nèi),比較這些細胞系在異種動物體內(nèi)成瘤性及腫瘤生長速度。觀察移植瘤細胞T29Nt和T80Nt的形態(tài)學特征,并將移植瘤細胞T29Nt和T80Nt再次接種到裸鼠皮下和腹膜腔內(nèi)。觀察生成的移植瘤的病理學特征,并檢測新生腫瘤相關(guān)蛋白的表達。
　　 [研究方法]
　　 1.裸鼠致瘤實驗,取對數(shù)

16、生長期的T29,T80,T29N,T80N細胞用無血清培養(yǎng)基配制,分別取5×106個T29,T80,T29N,T80N細胞接種于4-6周齡雌性裸鼠皮下,每只兩點,每2天觀察一次裸鼠,觀察腫瘤出現(xiàn)的時間和腫瘤的大小,測量腫瘤體積,繪出細胞生長曲線。皮下移植瘤直徑達到1.5cm時,處死裸鼠,切取腫瘤組織,繼續(xù)培養(yǎng)移植瘤細胞T29Nt和T80Nt,剩余組織以中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色。
　　 2.分別取5×106個T2

17、9,T80,T29N,T80N細胞接種于4-6周齡雌性裸鼠腹膜腔內(nèi)接種。腹膜腔內(nèi)細胞移植的裸鼠觀察6個月后處理。
　　 3.取對數(shù)生長期的細胞用無血清培養(yǎng)基配制,取5×106個T29Nt,T80Nt細胞分別接種于4-6周齡雌性裸鼠皮下,每只兩點；取5×106個T29Nt,T80Nt細胞分別接種于4-6周齡雌性裸鼠腹膜腔內(nèi)。觀察6個月后,處死實驗裸鼠后,切取皮下移植瘤及腹腔移植瘤組織以中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色,觀