MDM2、p53和SUMO-1影響肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究.pdf

1、第一部分:原發(fā)性肝癌MDM2基因表達(dá)與p53基因突變及腫瘤侵襲性的關(guān)系 目的:以原發(fā)性肝癌中MDM2基因表達(dá)為指標(biāo)，探討其與p53基因突變和腫瘤侵襲性有關(guān)的分子機(jī)理。 方法:應(yīng)用RT-PCR方法，總結(jié)本院72例原發(fā)性肝癌和65例相應(yīng)癌旁肝組織中MDM2的基因表達(dá)，研究其與p53基因突變和腫瘤侵襲性之間的關(guān)系。 結(jié)果:肝癌組織中MDM2基因表達(dá)值(50.17±5.23)％明顯高于癌旁肝組織(27.69±7.42)％

2、(P＜0.01)，侵襲性肝癌(59.08±7.27)％明顯高于非侵襲性肝癌(37.86±6.36)％(P＜0.05)。侵襲性肝癌的p53基因突變率(72.72％)明顯高于非侵襲性肝癌(25.64％)(P＜0.05)。而在不同大小肝癌中，MDM2基因表達(dá)值及p53突變率差異無顯著意義。無p53基因突變肝癌中的MDM2基因表達(dá)值(62.15±8.41)％明顯高于有突變者(38.57±4.82)％(P＜0.05)，MDM2低表達(dá)組肝癌的p53

3、突變率(56.14％)明顯高于MDM2高表達(dá)組(13.33％)(P＜0.05)。 結(jié)論:MDM2基因過表達(dá)、p53基因突變與肝細(xì)胞癌的侵襲性有關(guān)。MDM2基因過表達(dá)可能是p53基因失活的重要機(jī)制。 第二部分:原發(fā)性肝癌中MDM2、p53蛋白的表達(dá)及其臨床病理意義 目的:探討p53、MDM2蛋白表達(dá)在原發(fā)性肝癌中的相互關(guān)系和病理意義。 方法:應(yīng)用免疫組化方法，總結(jié)本院72例原發(fā)性肝細(xì)胞癌和65例相應(yīng)癌旁肝組

4、織中p53、MDM2的蛋白表達(dá)情況，并聯(lián)系臨床病理結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果:原發(fā)性肝細(xì)胞癌中p53、MDM2蛋白表達(dá)陽性率癌組織均明顯高于癌旁肝組織(分別為52.78％vs7.69％，P＜0.0001；26.39％vs6.15％，P＜0.01)，p53、MDM2兩者間蛋白表達(dá)陽性率差異無顯著意義(P＞0.05)，MDM2蛋白表達(dá)陽性率與腫瘤包膜是否完整及有無血管瘤栓顯著相關(guān)(分別為P＜0.0001，P=0.0001)，而與腫瘤

5、大小、有無并發(fā)肝炎肝硬化及病理分級無關(guān)(P＞0.05)。 結(jié)論:MDM2、p53蛋白高表達(dá)在HCC的發(fā)生中起重要作用，MDM2蛋白表達(dá)與肝癌侵襲性密切相關(guān)。 第三部分:SUMO-1在p53-MDM2反饋調(diào)節(jié)環(huán)中的作用機(jī)理 目的:研究小分子泛素樣修飾蛋白-1(smallubiquitin-likemodifier-1，SUMO-1)在p53-MDM2反饋調(diào)節(jié)環(huán)中的作用機(jī)理。 方法:用含人野生型p53基因質(zhì)粒

6、pcDNA3-wtp53(pwtp53)、含人雙微粒體基因2(murinedoubleminutegene2，MDM2，鼠雙微粒體基因2，人同源基因為HDM2)質(zhì)粒pCMV-HDM1B(pMDM2)、含人SUMO-1基因質(zhì)粒pcDNA3-His6-SUMO-1(pSUMO-1)和空質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，獲得各轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，應(yīng)用Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中質(zhì)粒蛋白的表達(dá)及流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例。 結(jié)果:

7、轉(zhuǎn)染pwtp53和pMDM2質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞均可見p53及MDM2蛋白條帶，同時轉(zhuǎn)染pSUMO-1質(zhì)粒的細(xì)胞分別可見被SUMO-1修飾的相對分子量較大的p53和MDM2蛋白條帶，在未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒、僅轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和pSUMO-1質(zhì)粒的細(xì)胞中只檢測到少量p53蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染pwtp53及pwtp53+pSUMO-1質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞凋亡比例分別為(16.79±1.62)％和(18.15±1.36)％，轉(zhuǎn)染pwtp53+pMDM2質(zhì)粒的細(xì)

8、胞凋亡比例則下降至(5.17±1.23)％，而轉(zhuǎn)染pwtp53+pMDM2+pSUMO-1質(zhì)粒的細(xì)胞凋亡比例則上升至(14.06±1.84)％，與轉(zhuǎn)染pwtp53+pMDM2質(zhì)粒的細(xì)胞相比差異有顯著性意義(P＜0.01)，其他細(xì)胞中的凋亡比例均≤2％，差異無顯著性意義(P＞0.05)。 結(jié)論:SUMO-1通過與p53蛋白的結(jié)合或翻譯后修飾，抑制MDM2等癌基因蛋白對p53蛋白的降解，可增強(qiáng)p53抑癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

9、第四部分:p53、MDM2和SUMO-1在抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)理 目的:探討p53、MDM2和SUMO-1在化療藥5-Fu誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡中的影響及其作用機(jī)理。 方法:5-Fu誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，以質(zhì)粒pCMV-HDM1B(pMDM2)和pcDNA3-His6-SUMO-1(pSUMO-1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，應(yīng)用Westernblot檢測經(jīng)藥物誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中內(nèi)源性p53蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，流式細(xì)胞儀

10、檢測細(xì)胞凋亡比例變化，免疫熒光顯微鏡觀察p53蛋白在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中的表達(dá)。 結(jié)果:隨藥物誘導(dǎo)濃度的增加，HepG2細(xì)胞內(nèi)源性p53蛋白表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡率與對照組相比明顯增高(P＜0.01)，于1×10-3mol/L濃度處最強(qiáng)，呈濃度依賴性，細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)均可見p53蛋白，且以細(xì)胞漿表達(dá)為主。轉(zhuǎn)染pMDM2的細(xì)胞具有明顯的抗凋亡特性，與同濃度未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，p53蛋白表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡率均明顯下降(P＜0.01)，p53蛋白

11、表達(dá)在細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)均減少。共轉(zhuǎn)染pSUMO-1的細(xì)胞其濃度-蛋白表達(dá)強(qiáng)度-凋亡率曲線又接近未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，與單純轉(zhuǎn)染pMDM2細(xì)胞相比差異有顯著性(P＜0.01)，細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)p53蛋白表達(dá)重新出現(xiàn)，且以核內(nèi)更明顯。只轉(zhuǎn)染pSUMO-1的細(xì)胞p53蛋白在細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)和凋亡率與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相似，兩者間差異無顯著性。 結(jié)論:SUMO-1通過抑制MDM2對p53在胞漿的降解及增強(qiáng)p53在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá),可促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)的