空腸彎曲菌灌胃經(jīng)小鼠消化道排出后毒力及致周圍神經(jīng)病變能力變化的研究.pdf

1、目的:研究不同來源的空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，Cj)經(jīng)過連續(xù)多批小鼠灌胃消化道排出后，與原代空腸彎曲菌相比，其各分離變異株間生長(zhǎng)繁殖能力、革蘭染色形態(tài)變化等毒力的不同;同時(shí)進(jìn)一步觀察分析空腸彎曲菌分離變異株間致周圍神經(jīng)病變能力的差異，為了解認(rèn)識(shí)在消化道環(huán)境中空腸彎曲菌毒力改變及不同毒力的空腸彎曲菌致周圍神經(jīng)病變能力的差異奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.復(fù)蘇培養(yǎng)原代空腸彎曲菌:選擇河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

2、神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中凍存的，分離自急性運(yùn)動(dòng)性軸索型（AMAN型）吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barresyndrome，GBS)患者糞便中的空腸彎曲菌lulei株和分離自單純細(xì)菌性腹瀉患者糞便中的空腸彎曲菌NCTC11168株。將它們于室溫溶化后，取500ul菌液倒入乘有5ml滅菌布氏肉湯培養(yǎng)基的潔凈西林瓶中，置于三氣培養(yǎng)箱中，在42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)環(huán)境下增菌24小時(shí)，后傳代至含7％脫纖維羊

3、血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，于相同環(huán)境條件下培養(yǎng)24小時(shí)，以同樣方法傳代至第3代，成功復(fù)蘇空腸彎曲菌。
　　2.空腸彎曲菌的鑒定:采用革蘭染色和馬尿酸鈉水解試驗(yàn)的方法鑒定空腸彎曲菌。
　　3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組方法:選用4周齡，體重18-20g，雄性清潔級(jí)健康昆明小鼠。共分為9個(gè)批次，每一批次3組，分別為lulei株組、NCTC11168株組和布氏肉湯對(duì)照組，每一組2只小鼠，共54只小鼠。
　　4.給菌方法和濃度:實(shí)

4、驗(yàn)組小鼠經(jīng)口灌胃3×108cfu/ml濃度的活菌菌懸液0.5ml;對(duì)照組小鼠灌胃滅菌布氏肉湯0.5ml，所有小鼠灌喂前均禁食水12小時(shí)，灌胃后立即給予食水。
　　5.空腸彎曲菌分離培養(yǎng):將原代空腸彎曲菌lulei株和NCTC11168株灌胃第一批次小鼠，共灌胃2次，間隔24小時(shí)，分別于灌胃后48小時(shí)和72小時(shí)采集小鼠糞便，并從糞便中分離純化上述2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的空腸彎曲菌分離變異株。將分離純化得到的72小時(shí)空腸彎曲菌lulei分離變異株

5、和NCTC11168分離變異株分別灌胃第二批次小鼠，以此類推，直至完成9個(gè)批次空腸彎曲菌的分離培養(yǎng)。
　　6.不同批次相同時(shí)間點(diǎn)，空腸彎曲菌分離變異株間生長(zhǎng)繁殖能力及革蘭染色形態(tài)變化觀察:細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖能力是評(píng)價(jià)細(xì)菌毒力的重要指標(biāo)，分別采用平板菌落計(jì)數(shù)法和革蘭染色的方法比較各空腸彎曲菌分離變異株間生長(zhǎng)繁殖能力及革蘭染色形態(tài)變化的差異。
　　7.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況的觀察:自灌胃當(dāng)日起每天觀察小鼠的狀態(tài):如進(jìn)食水情況、精神狀態(tài)、大

6、便性狀、皮毛光滑程度、體重及肢體活動(dòng)情況等，一般觀察時(shí)間為30天，之后處死解剖動(dòng)物，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)進(jìn)行神經(jīng)病理觀察，如動(dòng)物在30天內(nèi)出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀，隨時(shí)解剖取材病理觀察。
　　8.不同批次小鼠周圍神經(jīng)病理學(xué)檢查:采用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、鋨酸染色、甲苯胺藍(lán)染色和透射電子顯微鏡的方法觀察不同批次小鼠周圍神經(jīng)病理變化。
　　結(jié)果:
　　1.不同批次空腸彎曲菌分離變異株間單位時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)繁殖速度不同，各批次相同采集糞便

7、的時(shí)間點(diǎn)分離得到的變異株，隨著批次的增加空腸彎曲菌生長(zhǎng)繁殖能力逐漸增強(qiáng)，且呈現(xiàn)出非線性增強(qiáng)的趨勢(shì)。
　　2.不同批次空腸彎曲菌分離變異株間革蘭染色鏡檢觀察，形態(tài)發(fā)生變化。隨著批次增加，空腸彎曲菌lulei分離變異株菌體逐漸變長(zhǎng)、變細(xì)，螺旋桿狀或彎曲桿狀程度逐漸明顯，呈雙“S”形或三“S”形;空腸彎曲菌NCTC11168分離變異株間菌體逐漸變短，存在由“直桿狀”向“C”形變化的趨勢(shì)。
　　3.小鼠一般情況的觀察:第7批次lul

8、ei組1只小鼠于灌胃后72小時(shí)出現(xiàn)明顯雙側(cè)后肢完全癱瘓癥狀，完全依靠前肢拖拽活動(dòng)，活動(dòng)能力差，進(jìn)食水少，精神狀態(tài)不佳，毛豎起，體重?zé)o明顯減輕，大便性狀無明顯改變，余實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠在灌胃后30天解剖時(shí)活動(dòng)能力及進(jìn)食水情況如常，精神狀態(tài)好，體重?zé)o明顯減輕。
　　4.小鼠周圍神經(jīng)病理學(xué)觀察:第7批次lulei組1只癱瘓小鼠坐骨神經(jīng)出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，表現(xiàn)為:HE染色可見軸索粗細(xì)不均，表面不光滑，部分?jǐn)嗔?。免疫組織化學(xué)染色可見髓鞘斷裂

9、消失;軸索粗細(xì)不均、斷裂。鋨酸染色可見脫髓鞘表現(xiàn)，神經(jīng)髓鞘回縮，呈“城墻樣”改變，在郎飛氏節(jié)附近髓鞘回縮明顯;同時(shí)在郎飛氏節(jié)附近可見髓鞘再生。甲苯胺藍(lán)染色可見髓鞘脫落、斷裂，部分髓鞘向軸索方向脫落壓迫軸索，同時(shí)可見髓鞘再生，軸索出現(xiàn)華勒樣變性。透射電子顯微鏡觀察，可見線粒體脊消失，線粒體外膜腫脹;軸索膜與髓鞘膜分離，髓鞘板層結(jié)構(gòu)消失，呈同心圓樣向軸索方向回縮，壓迫軸索。余實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠在灌胃30天后解剖取坐骨神經(jīng)，采用上述方法觀察病

10、理學(xué)改變，表現(xiàn)為髓鞘及軸索光滑完整，未見神經(jīng)病理學(xué)變化。
　　結(jié)論:
　　1.不同來源的空腸彎曲菌lulei株和NCTC11168株經(jīng)連續(xù)多批次小鼠灌胃消化道分離后，相同采集糞便時(shí)間點(diǎn)得到的變異株間生長(zhǎng)繁殖能力隨著批次增加逐漸增強(qiáng)，且增強(qiáng)趨勢(shì)為非線性。空腸彎曲菌分離變異株間革蘭染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)出現(xiàn)連續(xù)性變化。說明空腸彎曲菌在經(jīng)過小鼠消化道排出體外后毒力增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)趨勢(shì)為非線性，空腸彎曲菌的形態(tài)在消化道環(huán)境影響下發(fā)生連續(xù)改

11、變。
　　2.不同毒力的空腸彎曲菌連續(xù)2次小鼠灌胃后，未出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀，但可以出現(xiàn)類似吉蘭-巴雷綜合征的癱瘓癥狀和周圍神經(jīng)病理改變。說明空腸彎曲菌在消化道環(huán)境中毒力增強(qiáng)不足以導(dǎo)致小鼠腹瀉癥狀的發(fā)生。雖然空腸彎曲菌與吉蘭-巴雷綜合癥間關(guān)系密切，然而，伴隨空腸彎曲菌毒力增強(qiáng)，其導(dǎo)致小鼠癱瘓癥狀及周圍神經(jīng)病理改變的能力未出現(xiàn)同步加強(qiáng)，說明擬通過使用經(jīng)小鼠消化道后毒力加強(qiáng)的空腸彎曲菌2次口服灌胃實(shí)驗(yàn)小鼠的方法，不能達(dá)到建立穩(wěn)定的類似吉蘭