PCOS動物模型及PCOS患者CYP19、GATA-4、FSHR基因表達的初步研究.pdf

1、研究目的和意義
　　 多囊卵巢綜合征(polycysitic ovary syndrome,PCOS)是育齡婦女中最常見的婦科內(nèi)分泌失調(diào)性疾病,發(fā)病率占全球育齡女性的5％～10％,占無排卵性不孕癥患者的30％～60％。此外,PCOS患者還較易發(fā)生糖尿病、心血管疾病以及子宮內(nèi)膜癌等遠期并發(fā)癥?？梢?PCOS是關(guān)乎女性一生的內(nèi)分泌和代謝紊亂性疾病。但當前關(guān)于PCOS病因?qū)W、診斷標準和最佳治療方案卻還存在許多爭論和懸而未決的問題,使P

2、COS成為研究熱點,而研究的重中之重是PCOS病因?qū)W的研究。
　　 本研究擬以CYP19、GATA-4和FSHR為研究對象,首先采用病例對照的研究形式初步檢測三種基因在PCOS患者卵巢中的表達水平。由于取材條件的限制,很有必要建立一個與PCOS婦女卵巢組織中CYP19表達相一致的模型來進一步研究這三種基因的作用及其相關(guān)性。由于來曲唑直接作用于P450芳香化酶,且其誘導的PCOS大鼠模型具有與人類PCOS患者極其相似的卵巢結(jié)構(gòu)方面

3、的改變,故本研究以來曲唑建造PCOS大鼠模型,檢測該PCOS大鼠模型卵巢組織中三種基因的表達水平,并對模型中三種基因表達間的相關(guān)性進行研究,同時也為該模型的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
　　 第一章:CYP19、GATA-4和FSHR蛋白在PCOS患者卵巢組織中的表達及其臨床意義
　　 目的:研究CYP19、GATA-4和FSHR蛋白在PCOS患者卵巢中的表達特點,為進一步探討CYP19、GATA-4和FSHR與PCOS發(fā)生

4、的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.標本來源與分組
　　 收集南方醫(yī)院、佛山市第一人民醫(yī)院、福州軍區(qū)總院符合鹿特丹診斷標準的多囊卵巢綜合癥患者16例。對照組9例,因單側(cè)卵巢腫瘤行對側(cè)卵巢剖探術(shù),或因子宮腫瘤行子宮及雙側(cè)附件切除術(shù)。兩組患者年齡無顯著性差異。所有組織均用10％中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,分別進行HE染色和免疫組化檢測。
　　 2.免疫組織化學方法檢測CYP19、GATA-

5、4和FSHR蛋白在卵巢組織中的表達
　　 卵巢組織常規(guī)石蠟包埋,2um切片行HE染色。5um切片行免疫組織化學染色。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化,3％H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,微波修復抗原,10％山羊血清室溫封閉,一抗孵育過夜,DAKO anti mouse,rabbit二抗室溫孵育30分鐘/DAKO anti-goat immunoglobulins/HRP二抗室溫孵育,DAB顯色,蘇木精復染后,1％鹽酸酒精分化,脫水,

6、透明,中性樹膠封片。
　　 3.結(jié)果判定
　　 CYP19和FSHR蛋白表達以棕黃色顆粒為陽性。染色強度以陽性細胞呈現(xiàn)的染色特征為標準進行計分:細胞未染色記為0分,呈淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分；GATA-4蛋白的表達產(chǎn)物定位于細胞核,由于采用了蘇木精復染,陽性細胞核大部分表現(xiàn)為棕黑色。染色特征標準計分為:細胞未染色記為0分,呈淡黑色為1分,棕黑色為2分,深黑色為3分。同樣物鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù),算出陽性細胞百

7、分比進行計分。0～5％為0分,6～25％為1分,26～50％為1分,51～75％為3分,>75％為4分。然后根據(jù)兩者相加所得的總分進行結(jié)果判定。0～1分為陰性(-),2～3分為弱陽性(+),4～5分為中度陽性(++),6～7分為強陽性(+++)。“+～+++”為陽性表達。
　　 4.統(tǒng)計分析
　　 統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行處理。計數(shù)資料兩組間比較采用Mann-Whitney Test檢驗,p<0.05為

8、差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 小結(jié):
　　 1.在早期卵泡,PCOS組顆粒細胞CYP19蛋白表達較對照組顯著性升高；在晚期卵泡,兩組顆粒細胞CYP19蛋白表達無顯著性差異。提示CYP19參與了早期卵泡的生長發(fā)育過程,早期卵泡顆粒細胞CYP19蛋白表達的過高與PCOS的發(fā)生有關(guān)。
　　 2.在早期卵泡,PCOS組顆粒細胞GATA-4蛋白表達較對照組顯著性升高；在晚期卵泡,兩組顆粒細胞GATA-4蛋白表達無顯著性差異。

9、提示GATA-4參與了早期卵泡的生長發(fā)育過程,早期卵泡顆粒細胞CYP19蛋白表達的過高與PCOS的發(fā)生有關(guān)。
　　 3.PCOS組的早期、晚期卵泡顆粒細胞FSHR蛋白表達與對照組的比較無顯著性差異(P=0.05)。提示PCOS患者早期卵泡顆粒細胞GATA-4和CYP19的表達升高可能是由FSH以外的其它因素所介導的。
　　 第二章:來曲唑誘導的SD大鼠PCos模型卵巢組織中FSHR、GATA-4和CYP19基因表達的研究

10、
　　 目的:PCOS的主要特征是雄激素增高和持續(xù)不排卵,卵巢局部高雄激素是導致PCOS的關(guān)鍵因為。P450芳香化酶為卵巢顆粒細胞上催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的限速酶,卵巢內(nèi)此酶活性的下降導致雄激素水平升高?；谶@種理論,采用芳香化酶抑制劑來曲唑給予雌性大鼠灌服,期望能夠建立一種理想的PCOS動物模型,并針對模型研究FSHR、GATA-4和CYP19基因的表達水平。
　　 研究方法:
　　 1.6周齡清潔級雌性SD大

11、鼠,隨機分為2組。模型組來曲唑1 mg(kg-1·d-1)溶于10g·L-1羧甲基纖維素(CMC)中,連續(xù)灌服21天。對照組給予同體積的溶劑(CMC)灌服。
　　 2.放免法測定兩組大鼠血清性激素(LH、FSH、E2、P、T)水平。
　　 3.HE染色觀察卵巢組織學變化。卵巢組織常規(guī)石蠟包埋,2μm切片行HE染色。
　　 4.熒光定量PCR(Realtime-PCR)。
　　 設(shè)計引物探針。組織液氮研磨,

12、加入Trizol,提取總RNA,合成cDNA,熒光定量PCR,制作擴增曲線及融解曲線,得到內(nèi)參、FSHR、GATA-4和CYP19基因相對拷貝數(shù),計算FSHR、GATA-4和CYP19與內(nèi)參相對拷貝數(shù)比值。比較模型組與對照組FSHR、GATA-4和CYP19基因表達的相對比值。
　　 5.免疫組織化學方法檢測CYP19、GATA-4和FSHR蛋白在卵巢組織中的表達
　　 5um切片行免疫組織化學染色。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯

13、度酒精水化,3％H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,微波修復抗原,10％山羊血清室溫封閉,一抗孵育過夜,DAKO anti mouse,rabbit二抗室溫孵育30分鐘/DAKO anti-goatimmunoglobulins/HRP二抗室溫孵育,DAB顯色,蘇木精復染后,1％鹽酸酒精分化,脫水,透明,中性樹膠封片。
　　 6.免疫組化結(jié)果判定 方法同前
　　 7.免疫印跡實驗(Western blotting)
　　

14、 組織研磨,細胞裂解,勻漿,超聲下震蕩,煮沸,蛋白濃度均調(diào)制4％。配制分離膠及濃縮膠,灌膠。上樣,電泳,PVDF膜,一抗孵育,脫脂奶粉封閉,二抗孵育,顯示結(jié)果。凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照分析目的條帶的灰度值。
　　 8.統(tǒng)計分析
　　 用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料結(jié)果以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,兩組間比較采用兩樣本t檢驗,兩組間均數(shù)相關(guān)分析采用Person相關(guān)分析。計數(shù)資料兩組間比較采用Mann-Wh

15、imey Test,p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 小結(jié):
　　 1.模型組卵巢組織中CYP19基因及蛋白的表達水平較正常對照組顯著增加。CYP19蛋白在模型中的表達結(jié)果與本實驗的第一部分檢測PCOS患者中的表達結(jié)果相符,進一步提示CYP19參與了早期卵泡的生長發(fā)育過程,CYP19的過高表達與PCOS的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 2.模型組卵巢組織中GATA-4基因及蛋白的表達水平較正常對照組顯著增加。

16、>　　 GATA-4蛋白在模型中的表達結(jié)果與本實驗的第一部分檢測PCOS患者中的表達結(jié)果相符,進一步提示GATA-4基因參與了早期卵泡的生長發(fā)育過程,GATA-4基因表達異常增高與PCOS的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 3.模型組卵巢組織中FSHR基因及蛋白的表達水平較正常對照組顯著增加。模型組顆粒細胞FSHR蛋白表達較對照組的升高,差異具有顯著性,該結(jié)果與與本實驗的第一部分檢測PCOS患者的FSHR蛋白表達的結(jié)果不相符?？紤]可能與模

17、型組血清FSH水平較對照組明顯升高有關(guān)。
　　 4.Pearson相關(guān)分析顯示:FSHR與GATA-4蛋白和基因表達存在顯著正相關(guān)關(guān)系,GATA-4與CYP19蛋白和基因表達兩者也存在顯著正相關(guān)關(guān)系。提示PCOS中CYP19表達的增高可能是由GATA-4的表達增高促使的。
　　 5.來曲唑誘導的SD大鼠出現(xiàn)與PCOS患者相似的卵巢病理改變及雄激素和黃體生成素水平升高等內(nèi)分泌變化,同時顆粒細胞CYP19和GATA-4蛋白表