PCOS動(dòng)物模型及PCOS患者LHR、INSR、AR基因甲基化的研究.pdf

1、研究目的和意義： 多囊卵巢綜合征(polycysticovariansyndrome，PCOS)是育齡期婦女的一種常見(jiàn)內(nèi)分泌紊亂性疾病。PCOS典型的病理生理改變主要包括LH水平升高、高胰島素血癥和高雄激素血癥，因此本研究擬以促黃體生成激素受體(luteinizationhormonereceptor，LHR)、胰島素受體(insulinreceptor，INSR)和雄激素受體(androgenreceptor，AR)為研究對(duì)像

2、，采用動(dòng)物模型和病例對(duì)照的研究形式探討三種受體基因是否存在異常的DNA甲基化，期望能夠打破PCOS遺傳學(xué)研究的瓶頸，在PCOS發(fā)病機(jī)制的研究中有所突破。 第一部分：DHEA誘導(dǎo)SD大鼠PCoS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究 PCOS起病多在青春期月經(jīng)初潮前后，其病理生理改變與腎上腺功能初現(xiàn)的生理變化驚人相似。 研究方法： 選取23日齡SD雌性大鼠，建模組每日皮下注射DHEA6mg/100g體重

3、，對(duì)照組每日皮下注射等體積油劑。注射20天后觀察兩組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)(HE染色)、性激素(E2、T、P、FSH、LH)及空腹血糖和胰島素的變化，并計(jì)算HOMA指數(shù)以評(píng)價(jià)胰島素抵抗?fàn)顩r。建模成功后利用甲基化特異性PCR技術(shù)，檢測(cè)建模組和對(duì)照組大鼠LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化狀態(tài)。 結(jié)果： 1.建模組和對(duì)照組一般情況的比較建模組大鼠的體重顯著低于對(duì)照組(P=0.000)；去除體重的影響后，建模組大鼠卵巢的重量略大于

4、對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P=0.317)。 2.建模組卵巢形態(tài)學(xué)改變建模組大鼠卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡多呈囊性擴(kuò)張，各級(jí)發(fā)育期卵泡及黃體少見(jiàn)，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，卵泡膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞增生。 3.建模組和對(duì)照組血清激素水平及胰島素抵抗的評(píng)估建模組大鼠血清E2、T、FSH、FINS、FBG均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)；LH水平較對(duì)照組有所升高，但無(wú)顯著性差異；LH/FSH比值兩組間無(wú)顯著性差異，HOMA指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P=0.

5、000)。 4.建模組和對(duì)照組卵巢LHR、INSR和AR基因的甲基化檢測(cè)建模組和對(duì)照組大鼠卵巢提取的LHR和AR基因經(jīng)甲基化特異性PCR后均未檢出甲基化條帶。INSR基因經(jīng)MSP后檢出甲基化條帶，甲基化率為73.3％，顯著高于對(duì)照組(16.7％)(P=0.000)。 小結(jié)： 1.利用DHEA成功誘導(dǎo)SD幼年雌性大鼠出現(xiàn)與PCOS患者相似的卵巢病理改變及雄激素升高和胰島素抵抗等典型內(nèi)分泌變化，建立了一種較為理想的P

6、COS動(dòng)物模型。 2.利用甲基化特異性PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠LHR、AR基因的甲基化狀態(tài)與對(duì)照組相似，INSR基因的甲基化率顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明AR、LHR基因并沒(méi)有發(fā)生DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，INSR基因則發(fā)生了DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，提示胰島素抵抗、高胰島素血癥可能是腎腺源性雄激素誘發(fā)PCOS的重要原因。 3.此模型大鼠胰島素水平和HOMA指數(shù)顯著高于對(duì)照組，同時(shí)利用甲基化特異性PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組

7、大鼠INSR基因的甲基化率顯著高于對(duì)照組，提示DNA甲基化介導(dǎo)的胰島素受體基因轉(zhuǎn)錄抑制是導(dǎo)致PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制之一。 第二部分：避孕硅膠棒聯(lián)合hCG誘導(dǎo)SD大鼠PCOS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究 LH與高雄激素血癥、胰島素抵抗等PCOS典型病理生理變化均密切相關(guān)，是PCOS起病的中間環(huán)節(jié)。 研究方法： 選取24日齡SD雌性大鼠，建模組皮下埋植左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒3mm/只，

8、3天后(27日齡)開(kāi)始皮下注射hCG1.5IU2/日。對(duì)照組27日齡始每日皮下注射等體積生理鹽水。注射9天后觀察兩組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)(HE染色)、性激素(E2、T、P、FSH、LH)及空腹血糖和胰島素的變化，并計(jì)算HOMA指數(shù)以評(píng)價(jià)胰島素抵抗?fàn)顩r。建模成功后利用甲基化特異性PCR技術(shù)，檢測(cè)建模組和對(duì)照組大鼠LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化狀態(tài)。 結(jié)果： 1.建模組和對(duì)照組一般情況的比較建模組大鼠卵巢重量(P=0.0

9、00)和體積(P=0.000)均顯著高于對(duì)照組。 2.建模組卵巢形態(tài)學(xué)改變建模組大鼠卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡多呈囊性擴(kuò)張，各級(jí)發(fā)育期卵泡及黃體少見(jiàn)，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，卵泡膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞增生。 3.建模組和對(duì)照組血清激素水平及胰島素抵抗的評(píng)估建模組大鼠血清P、T、LH、FINS、FBG水平均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)；LH/FSH比值(P=0.000)和HOMA指數(shù)(P=0.000)也均顯著高于對(duì)照組。 4.建模組和

10、對(duì)照組卵巢LHR、INSR和AR基因的甲基化檢測(cè)建模組和對(duì)照組大鼠卵巢提取的LHR和AR基因經(jīng)MSP后均未檢出甲基化條帶；建模組INSR基因經(jīng)MSP后檢出甲基化條帶，建模組的甲基化率為76.7％，顯著高于對(duì)照組(20.0％)(P=0.000)。 小結(jié)： 1.利用避孕硅膠棒聯(lián)合hCG成功誘導(dǎo)SD幼年雌性大鼠出現(xiàn)與PCOS患者相似的卵巢病理改變及LH升高、雄激素升高和胰島素抵抗等典型內(nèi)分泌變化，建立了一種較為理想的PCOS動(dòng)

11、物模型。 2.利用甲基化特異性PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠LHR、AR基因的甲基化狀態(tài)與對(duì)照組相似，INSR基因的甲基化率顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明AR、IMR基因并沒(méi)有發(fā)生DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，INSR基因則發(fā)生了DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，提示胰島素抵抗、高胰島素血癥可能是LH誘發(fā)PCOS的重要原因。 3.此模型大鼠胰島素水平和HOMA指數(shù)顯著高于對(duì)照組，同時(shí)利用甲基化特異性PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠INSR基因的

12、甲基化率顯著高于對(duì)照組，提示DNA甲基化介導(dǎo)的胰島素受體基因轉(zhuǎn)錄抑制是導(dǎo)致PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制之一。 第三部分：PCOS患者LHR、INSR、AR基因甲基化的研究 1935年Stein和Leventhal首次真正意義上提出PCOS的診斷和治療方法時(shí)，多囊卵巢(polycysticovary，PCO)就是Stein-Leventhal綜合征(S-L綜合癥)最為重要的臨床表現(xiàn)之一。 研究方法： 研究對(duì)

13、像均為盆腔輸卵管因素的繼發(fā)不孕患者，年齡25～34歲，BMI18.5～22.9，排除子宮內(nèi)膜異位癥，基礎(chǔ)性激素水平、空腹血糖和空腹胰島素水平均正常，均為長(zhǎng)周期降調(diào)節(jié)超促排卵方案且為首個(gè)IVF-ET治療周期。PCOS的診斷依照2003年的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)，但入選的患者均為稀發(fā)排卵或無(wú)排卵同時(shí)具有多囊卵巢的患者，并無(wú)高雄激素的臨床表現(xiàn)和/或高雄激素血癥。 結(jié)果： 1.PCOS組和對(duì)照組一般情況的比較最后參與本項(xiàng)研究的共有69例不孕

14、患者，其中PCOS組39例，對(duì)照組30例。兩組患者的年齡、BMI、月經(jīng)第3天基礎(chǔ)激素值(E2、T、P、FSH、LH)、空腹血糖和空腹胰島素均無(wú)顯著性差異，LH/FSH比值和HOMA指數(shù)亦無(wú)顯著性差異。 2.LHR、INSR和AR基因的甲基化檢測(cè)PCOS組和對(duì)照組卵巢黃素化顆粒細(xì)胞提取的LHR、.AR和INSR基因經(jīng)甲基化特異性PCR后，均未檢出完全化甲基化狀態(tài)的特征條帶，僅部分標(biāo)本檢測(cè)出半甲基化狀態(tài)的特征條帶。比較了PCOS組和

15、對(duì)照組三條基因的半甲基化狀態(tài)發(fā)生率，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。 小結(jié)： 本部分研究利用甲基化特異性PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)非雄激素增高的PCOS患者和對(duì)照組患者LHR、INSR和AR基因的甲基化狀態(tài)無(wú)顯著差異，提示PCOS患者出現(xiàn)卵巢PCO的改變目前還不能證實(shí)是通過(guò)LHR、AR和INSR基因的甲基化模式改變導(dǎo)致的，PCOS患者卵巢PCO改變的發(fā)生機(jī)制需要進(jìn)一步研究。 全文小結(jié)： 1.本研究模擬腎上腺源性

16、雄激素增高和LH水平增高均誘導(dǎo)SD幼年雌性大鼠出現(xiàn)了與PCOS患者相似的卵巢病理改變和內(nèi)分泌代謝變化，成功建立了兩種PCOS動(dòng)物模型。 2.利用甲基化特異性PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠LHR、AR基因的甲基化狀態(tài)與對(duì)照組相似，INSR基因的甲基化率則顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明AR、LHR基因并沒(méi)有發(fā)生DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，INSR基因則發(fā)生了DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，提示胰島素抵抗、高胰島素血癥可能是腎上腺源性雄激素和LH誘發(fā)

17、PCOS的重要原因。 3.兩種PCOS模型大鼠的胰島素水平和HOMA指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，同時(shí)利用甲基化特異性PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠INSR基因的甲基化率顯著高于對(duì)照組，提示DNA甲基化介導(dǎo)的胰島素受體基因轉(zhuǎn)錄抑制是導(dǎo)致PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制之一。既往研究認(rèn)為，胰島素受體后的信號(hào)傳導(dǎo)障礙是PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制，本研究結(jié)果卻提示，胰島素受體本身的功能可能因胰島素受體基因的甲基化而受到影響，這對(duì)PCOS胰島素抵抗