玉郎傘黃酮成分的單體分離與藥效研究.pdf

1、目的：⑴考察玉郎傘總黃酮的提取工藝：在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)玉郎傘總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。⑵分離、純化玉郎傘黃酮的單體成分并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定：運(yùn)用先進(jìn)的植化分離、純化、鑒定技術(shù)，得到玉郎傘黃酮的活性單體并鑒定結(jié)構(gòu)。⑶玉郎傘黃酮單體的抗氧化、抗凝血、耐缺氧作用研究。⑷研究玉郎傘黃酮單體及含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷(H/R)的作用。⑸研究玉郎傘黃酮單體及含藥血清對(duì)H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。 方法：①YLS總黃酮的提取工藝

2、考察；②玉郎傘黃酮成分的單體分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定；③玉郎傘黃酮單體的抗氧化、抗凝血、耐缺氧作用研究；④研究玉郎傘黃酮單體及含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞H/R的作用；⑤玉郎傘黃酮單體及含藥血清對(duì)H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制 結(jié)果：⑴YLS總黃酮的提取方法優(yōu)化。確定以微波輔助萃取的方式進(jìn)行玉郎傘總黃酮的提取。具體工藝為：將YLS飲片粉碎，以60％乙醇為提取溶劑，料液比1:8，提取溫度<60℃,微波功率240 W，提取時(shí)間20 min，

3、提取1次。按此方法操作，總黃酮提取率為：3.16％(以生藥計(jì))，總黃酮含量為22.5％(以蘆丁為對(duì)照)。⑵玉郎傘黃酮成分的單體分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定。YLS A: C17H16O3，淡黃色針晶，mp.120.0-121.0℃；UV(MeOH)λmax(nm):260,300； ESI-MS m/z:291.17[M+Na]+,307.13[M+K]+.IR(KBr)(cm-1):3501,3123,2929,2852,1789,1623,

4、1604,1568,1528,1462,1372,1285,1228,1165,1133；1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δ:3.86(6H,s,H-OCH3X2, H-7,8),7.60(1H, brd, J=6.9 Hz, H-4),7.60(5H,m. H-2'、3'、4'、5'、6'),7.72(1H, J=8.8Hz, H-α),8.00(1H,d,J-8.8Hz,H-β),8.13(2H, brd, J=6.5Hz

5、, H-3,5)；13CNMR(DMSO-d6,125 MHz)δ:174.2(C-7'),110.6(C-α),121.5(C-β),119.6(C-1),147.8(C-2,6),128.6(C-3,5),130.9(C-4),130.9(C-1'),129.2(C-2'、3'、4'、5'、6'),60.2(C-7)，60.2(C-8)。結(jié)合HSQC、HMBC、NOSEY譜，確定其結(jié)構(gòu)式為：Cis(順)-2,6-=甲氧基查爾酮，首次

6、從YLS植物中分離，經(jīng)查閱SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)表明：此化合物亦為首次分離及報(bào)道核磁數(shù)據(jù)。YLS B: C18H14O4，桔色方晶，mp.135.0-136.0℃；UV(MeOH)λmax(nm):238,350； ESI-MS m/z:295.00[M+H]+,610.99[2M+Na]+,263.35[M-OMe]+； IR(KBr)(cm-1):3501,3133,2929,2831,1739,1600,1562,1474,13

7、80,1262,1219,1137,1102,1062,1025；1HNMR( CDCl3,500MHz),δ:3.95(3H,s,-OCH3),7.2(1H,d,H-5’),8.2(1H,d,H-4’),8.17(2H,s,H-2’,6’),7.77(1H,s,H-α),7.57(5H, m. H-2,3,4,5,6)；13CNMR(CDCl3,125MHz),δ:60.2(C-9’),104.2(C-α),110.0(C.5’),1

8、17.0(C-3’),119.8(C-8’),122.0(C-1’),128.4(C-2’),128.6(C-2,4,6),130.6(C-3,5),141.8(C-1),145.7(C-4’),150.0(C.6’),154.8(C-7’),158.2(C-β),175.0(C=O)；Crystal data: Monocli-nic, P2(1)/c,a=10.8813(16)nm,b=9.7954(14) nm,c=13.3473

9、(19) nm,α=900,β=103.697(2)°，γ=90°, V=1382.2(3) nm3,2-4, Dc=1.414 mg/m3,F(000)=616,μ=0.100mm-1。確定其結(jié)構(gòu)式為：Cis(順)-6’-甲氧基-β-羥基-苯駢呋喃查耳酮，系首次從YLS植物中分離。經(jīng)查SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)未見相同結(jié)構(gòu)報(bào)道，為一新化合物。⑶玉郎傘黃酮單體的抗氧化、抗凝血、耐缺氧作用：與空白對(duì)照組相比，YLS A～B單體的低、中、高濃

10、度(終濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg.ml-1)均能清除·O2、·OH，抑制·02-的生成(P<0.01)并呈濃度依賴性。其中，高濃度組效果最佳；與正常對(duì)照組相比，YLS A～B低劑量組均無(wú)明顯抗凝血作用(P>0.05)：YLS A～B中、高劑量組則可使凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。其中，高劑量組效果最好，抗凝作用與肝素鈉相似(P>0.05 vs Heparin)；與正常對(duì)照組相比，YLS A～B低劑量組的存活時(shí)間無(wú)差異(P

11、>0.05)，YLS A～B中、高劑量組則可顯著延長(zhǎng)缺氧小鼠的存活時(shí)間(P<0.01)，其中，高劑量組效果最好，耐缺氧作用與Vit.C相似(P>0.05)。⑷玉郎傘黃酮單體及含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞H/R的作用。心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：光鏡下可見原代培養(yǎng)3～4d后，心肌細(xì)胞融合成片，呈放射狀排列，細(xì)胞之間伸出多個(gè)偽足交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞搏動(dòng)同步化；H/R模型組心肌細(xì)胞胞漿空泡形成，細(xì)胞偽足收縮或消失，細(xì)胞折光率下降，異形心肌細(xì)胞數(shù)目增加并有大量細(xì)胞脫

12、離、懸浮、溶解壞死，體內(nèi)搏動(dòng)幅度及頻率減弱，節(jié)律不齊；YLS A～B單體及含藥血清組可見少量的心肌細(xì)胞偽足回縮，細(xì)胞脫落懸浮現(xiàn)象，但損傷程度較模型組顯著減輕且死亡細(xì)胞明顯減少；與模型組相比，YLS A～B單體及含藥血清中、高劑量可顯著增加心肌細(xì)胞活力及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、降低心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清夜中MDA、LDH、iNOS、TNF-a含量(活性)、增加T-SOD、GSH、cNOS、tNOS活性(P<0.

13、05)。⑸玉郎傘黃酮單體及含藥血清對(duì)H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。與模型組相比，中、高劑量的YLS A～B單體及含藥血清能明顯降低H2O2誘發(fā)所致心肌細(xì)胞的凋亡(P<0.01)并呈劑量依賴性，以高劑量組效果最明顯；與模型組相比，中、高劑量的YLS A～B單體及含藥血清均能下調(diào)NF-κBp65、Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、增加Bcl-2/Bax比值(P<0.01)。 結(jié)論：①首次從YLS植物中分離出兩個(gè)黃酮類活

14、性單體，其中一個(gè)為新化合物，另一個(gè)系首次從植物中分離并報(bào)道核磁數(shù)據(jù)。②兩個(gè)YLS黃酮活性單體均具有抗氧化、抗凝血、耐缺氧、保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷、減輕心肌細(xì)胞凋亡的作用，并呈一定的劑量依賴性；其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激損傷、提高GSH、cNOS、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、降低LDH、iNOS、TNF-a活性、下調(diào)NF-κBp65和Bax蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、增加Bcl-2/Bax比值而抑制心肌