孤核受體NR4A1在胰島β細(xì)胞中的功能與調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、目前，NR4A1在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中的作用尚有爭議。胰腺β細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)經(jīng)常面臨各種不利條件，如高濃度的游離脂肪酸(FFA)和持續(xù)的高血糖，而嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡。本研究的目的是分析NR4A1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡中的作用，并探索相關(guān)的機(jī)制。我們證實(shí)，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(TG)或棕櫚酸(PA)處理MIN6細(xì)胞和小鼠胰島可導(dǎo)致NR4A1的mRNA和蛋白質(zhì)水平增高。MTT結(jié)果表明在MIN6細(xì)胞中過表達(dá)NR4

2、A1能夠抵抗由TG或PA誘導(dǎo)的細(xì)胞損失;TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NR4A1過表達(dá)也能防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。利用siRNA敲出MIN6細(xì)胞中NR4A1的表達(dá)以及利用NR4A1敲除小鼠進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。在MIN6細(xì)胞中過表達(dá)NR4A1可降低TG或PA引起的C/ EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá)和Caspase3的活化。在MIN6細(xì)胞和小鼠胰島中過表達(dá)NR4A1可導(dǎo)致SURVIVIN表達(dá)的上調(diào)。我們證實(shí)在SURVIVIN的啟動子上

3、（-1872bp至-1866bp）有一個NR4A1的結(jié)合位點(diǎn)，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，NR4A1與SURVIVIN啟動子有物理結(jié)合。綜上所述，NR4A1通過上調(diào)SURVIVIN的表達(dá)和下調(diào)CHOP的表達(dá)來保護(hù)胰島β細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，我們稱之為“正向的和負(fù)向的調(diào)節(jié)”。
　　第一部分 胰島β細(xì)胞中NR4A1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)聯(lián)
　　目的:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑對NR4A1的表達(dá)的影響以及NR4A1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的β細(xì)胞凋亡

4、的作用。
　　方法:
　　1.用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG(0.5μM)或PA(0.4 mM)分別處理MIN6細(xì)胞，收取不同時間點(diǎn)樣品，提取RNA和蛋白，分別用熒光定量PCR和Western blot檢測隨TG或PA刺激時間的延長，NR4A1以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子CHOP在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　2.取16周齡的C57BL/6J小鼠，斷頸處死，提取并分離純化小鼠胰島，將所提取胰島平均分組，用0.5μM TG或0.

5、4 mM PA分別處理不同時間，提取RNA，用熒光定量PCR法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子BIP，CHOP以及NR4A1的表達(dá)變化。
　　3.取16周齡的C57BL/6J小鼠，斷頸處死，提取并分離純化小鼠胰島，0.5μM TG或?qū)φ杖軇〥MSO分別處理6小時，收集胰島細(xì)胞，用胰島素一抗及NR4A1一抗雙染，檢測NR4A1在胰島β細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)的情況。
　　4.用過表達(dá)NR4A1的慢病毒感染MIN6細(xì)胞，建立穩(wěn)定過表達(dá)NR4A1的

6、MIN6細(xì)胞克隆，用0.5μM TG或0.4 mM PA分別處理不同時間，用MTT方法檢測細(xì)胞的存活率;用0.5μM TG或0.4 mM PA處理過表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞及對照細(xì)胞24小時，用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡比率。
　　結(jié)果:
　　1.用0.5μM TG處理MIN6細(xì)胞后，可誘導(dǎo)NR4A1表達(dá)升高，其mRNA水平在1小時即有明顯升高，2小時達(dá)到最高峰，其蛋白水平則逐漸升高，CHOP也明顯升高，說明0.5μM T

7、G成功誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生;用0.4 mM PA處理MIN6細(xì)胞也可誘導(dǎo)NR4A1表達(dá)升高，在16小時達(dá)到高峰，同時CHOP也明顯升高。
　　2.分離純化小鼠胰島后，用0.5μM TG處理后，NR4A1的mRNA在0.5 h即有明顯升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子BIP和CHOP也明顯升高;用0.4 mM PA處理后，NR4A1在6小時即有明顯升高，CHOP也顯著升高。
　　3.0.5μMTG能誘導(dǎo)NR4A1表達(dá)升高（綠色），而D

8、MSO并不能誘導(dǎo)NR4A1表達(dá)升高，并且NR4A1大部分與胰島素（紅色）共定位。
　　4.成功建立穩(wěn)定過表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞株，過表達(dá)NR4A1的細(xì)胞稱為OV細(xì)胞，對照細(xì)胞稱為NC細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示，用0.5μM TG或0.4 mM PA處理后，OV細(xì)胞的存活率明顯高于NC細(xì)胞;TUNEL結(jié)果也顯示，TG或PA處理后NC細(xì)胞的凋亡陽性率明顯高于OV細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.無論在MIN6細(xì)胞還是小鼠胰島β細(xì)

9、胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG和PA均可誘導(dǎo)NR4A1表達(dá)升高。
　　2.過表達(dá)NR4A1可抵抗TG和PA引起的β細(xì)胞的凋亡，而沉默或敲除NR4A1后TG和PA更易導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 NR4A1對UPR反應(yīng)中各通路的影響
　　目的:研究NR4A1是通過影響UPR反應(yīng)中的哪一條信號途徑來抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡。
　　方法:
　　1.用0.5μM TG處理穩(wěn)定過表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞以及對照細(xì)胞，

10、收集不同時間點(diǎn)的細(xì)胞樣品，提取RNA，用熒光定量PCR法檢測IRE1通路中sXBP1與tXBP1的比值變化，PERK通路中ATF4的表達(dá)變化以及ATF6通路中ATF6的表達(dá)變化。
　　2.用0.5μM TG處理穩(wěn)定過表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞以及對照細(xì)胞，收集不同時間點(diǎn)的細(xì)胞樣品，提取RNA和蛋白，分別以熒光定量PCR和western blot檢測PERK通路中CHOP，eif2α以及其磷酸化形式(P-eif2α)的表達(dá)變化。<

11、br>　　結(jié)果:
　　1.0.5μM TG處理后，NC和OV細(xì)胞在3小時就都發(fā)生了XBP1的剪切，但NC和OV細(xì)胞中的sXBP1/tXBP1并沒有明顯差異;而PERK通路中的ATF4在TG處理后都有所提高，但在OV細(xì)胞中提高的幅度明顯低于NC細(xì)胞;而ATF6在兩組細(xì)胞中也無明顯差異。
　　2.0.5μMTG處理后，NC和OV細(xì)胞中的CHOP在mRNA和蛋白水平上均有明顯升高，但是在OV細(xì)胞的表達(dá)要明顯低于NC細(xì)胞;在TG的作

12、用下，eif2α在兩種細(xì)胞中并無明顯區(qū)別，在NC細(xì)胞中eif2α持續(xù)磷酸化，而在OV細(xì)胞中從12小時開始，磷酸化的eif2α發(fā)生去磷酸化。
　　結(jié)論:
　　1.NR4A1對UPR反應(yīng)中IRE1和ATF6通路無明顯影響，但可以通過改變PERK通路中的相應(yīng)分子的變化來抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　2.過表達(dá)NR4A1可以使P-eif2α發(fā)生去磷酸化，推測NR4A1可能通過改變GADD34來影響eif2α的磷酸化。
　　第三部

13、分 NR4A1對抗凋亡基因的影響
　　目的:研究在胰島β細(xì)胞中NR4A1能夠調(diào)控哪些抗凋亡基因的表達(dá)來抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。
　　內(nèi)容:
　　1.提取過表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞及對照細(xì)胞的RNA和蛋白，熒光定量PCR和westernblot檢測NC及OV細(xì)胞中抗凋亡相關(guān)基因NF-κB，BCL-2，SURVIVIN的表達(dá)差異。
　　2.用過表達(dá)NR4A1的腺病毒及對照病毒感染MIN6細(xì)胞48小時，收集蛋

14、白樣品，westernblot檢測NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在蛋白水平上的差異表達(dá)。
　　3.取16周齡的C57BL/6J小鼠，斷頸處死，提取并分離純化小鼠胰島，用過表達(dá)NR4A1的腺病毒及對照腺病毒瞬時感染48小時，提取RNA，以熒光定量PCR檢測NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA水平的差異表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.在OV細(xì)胞中，NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA和蛋白水平

15、上的表達(dá)都明顯高于NC細(xì)胞。
　　2.Ad-NR4A1感染的MIN6細(xì)胞中，NR4A1和SURVIVIN的表達(dá)都明顯高于Ad-GFP感染的MIN6細(xì)胞。
　　3.Ad-NR4A1感染的小鼠胰島細(xì)胞中，NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA水平上的表達(dá)都明顯高于對照細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　NR4A1能夠調(diào)控抗凋亡基因SURVIVIN，NF-κB及BCL-2的表達(dá)，且對SURVIVIN的調(diào)控是直接的，而對N