三氧化二砷和長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞株凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是常見的骨骼原發(fā)性惡性腫瘤,其好發(fā)于青少年,且易早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移,5年生存率低,是嚴(yán)重影響青少年身心健康的惡性疾病。盡管在早期手術(shù)及輔助化療可以明顯改善患者的預(yù)后,但仍為目前死亡率和致殘率較高的惡性疾病。而對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者化療為唯一有效的方法。目前可供臨床選用化療藥物有限,也普遍存在耐藥的問題,因此,研制、篩選毒副作用小,療效高的抗癌藥物,已成為當(dāng)前十分重要的領(lǐng)域。三氧化二砷(ars

2、enic trioxide,As2O3)已經(jīng)應(yīng)用于治療復(fù)發(fā)性急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL,M3),且療效顯著。但對(duì)于三氧化二砷治療骨肉瘤的研究較少。長(zhǎng)春新堿(vincristine,VCR)已經(jīng)應(yīng)用于治療骨肉瘤,但其具體治療分子機(jī)制研究尚少。本實(shí)驗(yàn)主要研究三氧化二砷及長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)體外骨肉瘤細(xì)胞株MG-63凋亡及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制,為以后臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:將MG-63細(xì)胞置于37℃,飽和濕

3、度5％CO2的10％DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 1光鏡觀察:將不同濃度的三氧化二砷和長(zhǎng)春新堿作用于MG-63細(xì)胞,在倒置相差顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并照相。
　　 2 MTT法:調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml,以每孔100ul培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,用不同濃度三氧化二砷(10、8、6、4μmol/L)和長(zhǎng)春新堿(4、2、1、0.5μg/ml)作用不同時(shí)間(

4、24h、36h、48h、60h),采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 3流式細(xì)胞術(shù):不同濃度三氧化二砷和長(zhǎng)春新堿作用36h;對(duì)照組(不含藥),8μmol/L三氧化二砷作用分別24h、36h、48h和60h,2μg/ml長(zhǎng)春新堿作用作用12h、24h、36h和48h,收集細(xì)胞。收集細(xì)胞數(shù)為(1～5)×106個(gè),胰酶消化后用1％小牛血清終止,500～1000r/min離心5min,棄去上清,3ml P

5、BS洗一次,加入冰預(yù)冷的70％的乙醇固定,4℃,1h。離心棄去固定液,PBS洗一次,加入碘化丙錠(Propidium Iodide,PI:50mg/LTrinton X-1001.0％)4℃避光染色30min,用Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布,應(yīng)用軟件進(jìn)行分析。
　　 4 Western印跡法觀察三氧化二砷及長(zhǎng)春新堿作用于人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63后PCNA、Caspase-3、CyclinDl、Cycl

6、inE、Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1倒置相差顯微鏡下觀察可見經(jīng)三氧化二砷及長(zhǎng)春新堿作用MG-63細(xì)胞后,細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng),隨濃度的增加,開始細(xì)胞形狀由梭形變?yōu)閳A形,但細(xì)胞膜完整,然后細(xì)胞開始皺縮,圓形細(xì)胞逐漸增多,細(xì)胞貼壁能力減弱,漂浮。隨后細(xì)胞體積普遍變小,胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,胞膜不完整,貼壁細(xì)胞少見,最后大部分細(xì)胞漂浮,變化更加明顯,基本無貼壁細(xì)胞。
　　 2不同濃度三氧化二砷(1

7、0、8、6、4μmol/L)和不同濃度長(zhǎng)春新堿(4、2、1、0.5μg/m1)作用MG-63細(xì)胞24h、36h、48h、60h,MTT結(jié)果顯示三氧化二砷和長(zhǎng)春新堿均能明顯抑制MG-63細(xì)胞增殖,并呈劑量和時(shí)間依賴性(p＜0.05)。
　　 3 FCM分析發(fā)現(xiàn),不同濃度三氧化二砷(10、8、6、4μmol/L)處理細(xì)胞36h及8μmol/L三氧化二砷處理細(xì)胞24h、36h、48h、60h,G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰,S期細(xì)胞所占比

8、例隨藥物濃度和時(shí)間增加呈上升趨勢(shì),所占比例最高達(dá)81.4％,而G1期所占比例明顯減少。不同濃度長(zhǎng)春新堿(4、2、1、0.5μg/m1)處理細(xì)胞36h及2μg/ml長(zhǎng)春新堿處理細(xì)胞12h、24h、36h、48h后,G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰,G2/M期所占比例隨藥物濃度和時(shí)間增加呈上升趨勢(shì),最大所占比例為92.5％,而G1期所占比例明顯減少。
　　 4 western-blotting結(jié)果:經(jīng)三氧化二砷和長(zhǎng)春新堿處理過的骨肉瘤細(xì)胞

9、與對(duì)照組相比均表現(xiàn)出PCNA、CyclinD1、CyclinE和Bcl-2蛋白表達(dá)抑制,Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1三氧化二砷和長(zhǎng)春新堿均有誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡和抑制增殖的作用,且具有時(shí)間.劑量依賴關(guān)系。隨時(shí)間延長(zhǎng)不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞的最終抑制作用一致。低濃度藥物作用長(zhǎng)時(shí)間和高濃度藥物作用短時(shí)間對(duì)細(xì)胞抑制作用一致。提示凋亡峰最高時(shí)的濃度可能是最適濃度。
　　 2長(zhǎng)春新堿對(duì)

10、骨肉瘤細(xì)胞MG-63顯示出明顯G2/M期阻滯作用,并可誘導(dǎo)其凋亡,且有一定的時(shí)間-劑量依賴性。三氧化二砷在細(xì)胞增殖周期中將細(xì)胞阻滯于S期細(xì)胞,從而干擾細(xì)胞DNA或蛋白質(zhì)的合成。
　　 3.As2O3及VCR作用于骨肉瘤細(xì)胞MG-63后通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá)而增強(qiáng)Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過抑制CyclinD1及CyclinE蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。
　　 4三氧化二砷可與長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用治療