Mtor siRNA聯(lián)合雷帕霉素對(duì)人食管癌移植瘤組織中mTOR基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、食管癌是常見的惡性腫瘤之一,我國是世界上食管癌高發(fā)國家,也是世界上食管癌高死亡率的國家之一。河南省又是食管癌的高發(fā)省份,目前的治療方法對(duì)中、晚期食管癌而言,療效均不太確切且有一定的局限性,因此,尋找新的更有效的治療食管癌的方法,已成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)癌基因的表達(dá)產(chǎn)物均是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組成成分,它們可以從多個(gè)環(huán)節(jié)參與并干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,研究表明,mTOR所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與多種惡性

2、腫瘤有關(guān),如乳腺癌、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等均存在mTOR信號(hào)通路的顯著激活,所以,目前mTOR已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
　　 為體內(nèi)觀察雷帕霉素及mTORsiRNA對(duì)食管癌細(xì)胞中mTOR、VEGF及HIF-1α表達(dá)的影響,本研究構(gòu)建了裸鼠人食管癌移植瘤模型,采用免疫組化PV法檢測(cè)裸鼠人食管癌移植瘤組織中mTOR基因、VEGF基因及HIF-1α基因蛋白的表達(dá):采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)裸鼠人食管癌移植瘤組織中nTOR mRNA的表達(dá)；

3、為臨床應(yīng)用RNA干擾技術(shù)及雷帕霉素靶向治療食管癌提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 1.人食管癌EC-1細(xì)胞株由香港大學(xué)曹世華教授惠贈(zèng)；BALB/C裸小鼠25只,雌性,鼠齡4周,體質(zhì)量16～21g,于河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室裸鼠室飼養(yǎng),飼養(yǎng)在恒濕、恒溫的半屏障系統(tǒng)中,飼料及飲水均經(jīng)滅菌處理,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。
　　 2.食管癌EC-1細(xì)胞的培養(yǎng):復(fù)蘇食管癌EC-1細(xì)胞,RPMI-1640培養(yǎng)

4、液(含10％胎牛血清,青霉素10u/ml,鏈霉素100u/ml),37℃、5％CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。
　　 3.mTOR siRNA的體外合成、鑒定、篩選:首先設(shè)計(jì)合成mTOR siRNA的寡核苷酸模板,5'端為T7啟動(dòng)子序列,在體外和T7 RNA聚合酶特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄出目的siRNA。分別合成一段無義對(duì)照siRNA和2段特異性siRNA,應(yīng)用40g/L瓊脂糖凝膠電泳,以定量模板DNA為參照,測(cè)定siRNA的長度和濃度；通過預(yù)實(shí)驗(yàn)

5、篩選出一段干擾效果較好的特異性mTOR siRNA。轉(zhuǎn)染:應(yīng)用Lipofecter脂質(zhì)體按說明書將mTOR siRNA轉(zhuǎn)染EC-1細(xì)胞。
　　 4.裸鼠移植瘤模型的建立和分組:先構(gòu)建裸鼠人食管癌移植瘤模型,待腫瘤長出1周后,將荷瘤小鼠隨機(jī)分為雷帕霉素組[腹腔注射雷帕霉素,50μg/(kg·次)]、mTORsiRNA組[mTO(R)siRNA組,腹腔注射mTOR siRNA,3μg/(只·次)]和聯(lián)合注射組(先注射mTOR siR

6、NA,第2天注射雷帕霉素,注射劑量同上),另設(shè)空白對(duì)照組(腹腔注射PBS代替藥物)及順鉑對(duì)照組[腹腔注射常規(guī)化療藥順鉑1mg/(kg·次)]；每組各5只。連續(xù)治療2周；治療結(jié)束將各組裸鼠頸椎脫臼處死,迅速剪開皮膚,完整剝離腫塊,用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長徑(a)、短徑(b),按公式求出腫瘤近似體積(V),V=1/2ab2。將組織塊置入4％多聚甲醛溶液中固定24小時(shí),常規(guī)石蠟包埋,4um連續(xù)切片。以備免疫組化,原位雜交使用。
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7、.應(yīng)用免疫組化PV法檢測(cè)各組裸鼠人食管癌移植瘤組織中mTOR蛋白、VEGF蛋白及HIF-1α蛋白的表達(dá)。
　　 6.采用原位雜交方法,檢測(cè)各組裸鼠人食管癌移植瘤組織中mTORmRNA的表達(dá)。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SAS9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果
　　 1.各組裸鼠人食管癌移植瘤的瘤體積和重量的變化:雷帕霉素組、mTORsiRNA組

8、、二者聯(lián)合治療組分別與空白對(duì)照組相比,移植瘤的體積均有所減小,重量均有所減輕,移植瘤的體積和重量與空白對(duì)照組的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；雷帕霉素組、mTOR siRNA組、二者聯(lián)合治療組分別與順鉑對(duì)照組相比,移植瘤的體積和重量降低均不及順鉑組明顯,雷帕霉素組、mTOR siRNA組、二者聯(lián)合治療組分別與順鉑組相比,移植瘤的體積和重量差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；單獨(dú)應(yīng)用雷帕霉素和單獨(dú)應(yīng)用mTOR siRNA時(shí)裸鼠移植

9、瘤體積和重量的降低均不及二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)降低的明顯,雷帕霉素組、mTOR siRNA組分別與聯(lián)合治療組相比,移植瘤的體積和重量差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；雷帕霉素組和mTOR siRNA組之間相比,移植瘤體積及重量的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；聯(lián)合治療組和順鉑對(duì)照組相比,移植瘤體積及重量的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。
　　 2.免疫組織化學(xué)結(jié)果:與空白對(duì)照組和順鉑對(duì)照組相比,雷帕霉素組、mTOR.si

10、RNA組、二者聯(lián)合治療組均可下調(diào)裸鼠人食管癌移植瘤組織中mTOR、VEGF及HIF-1α蛋白的表達(dá),分別與空白對(duì)照組和順鉑對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；且以二者聯(lián)合治療組中,mTOR、VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)下調(diào)的均最明顯,分別與單獨(dú)應(yīng)用雷帕霉素組、單獨(dú)應(yīng)用mTOR siRNA組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；
　　 3.原位雜交結(jié)果:與空白對(duì)照組和順鉑對(duì)照組相比,雷帕霉素組、mTORsiRN

11、A組、二者聯(lián)合治療組均可抑制裸鼠人食管癌移植瘤組織中mTORmRNA的表達(dá),分別與空白對(duì)照組和順鉑對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);且以二者聯(lián)合治療組抑制mTORmRNA表達(dá)最明顯,分別與單獨(dú)應(yīng)用雷帕霉素組、單獨(dú)應(yīng)用mTOR siRNA組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；
　　 結(jié)論
　　 1.mTORsiRNA可抑制裸鼠食管癌移植瘤的生長,并可抑制裸鼠食管癌移植瘤組織中mTOR蛋白、mRNA的表

12、達(dá),提示mTORsiRNA可特異性地抑制mTORmRNA從而抑制PI3K/AKT/mTOR通路,進(jìn)而抑制食管癌的生長。
　　 2.mTORsiRNA、雷帕霉素均可抑制裸鼠食管癌移植瘤組織中VEGF蛋白、HIF-1α蛋白的表達(dá),提示mTORsiRNA、雷帕霉素均可抑制血管淋巴管的生成,從而抑制腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。
　　 3.mTORsiRNA聯(lián)合雷帕霉素對(duì)裸鼠食管癌移植瘤的生長及移植瘤組織中mTOR蛋白、mRNA、VEGF蛋白