調(diào)節(jié)性T細(xì)胞下調(diào)對(duì)小鼠腹腔人食管癌移植瘤的影響.pdf

1、背景與目的:食管癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率一直居高不下，我國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)之一。近年來(lái)，隨著認(rèn)知水平的提高，人們對(duì)食管癌展開了大量的臨床及基礎(chǔ)研究，在其發(fā)生發(fā)展及診療等方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但其防治工作仍未達(dá)到令人滿意的程度，食管癌5年生存率始終低于30％。腫瘤進(jìn)展是一個(gè)多因素、多基因、多階段過程，免疫機(jī)制及相關(guān)治療在遏制其發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用。作為一種特殊的T細(xì)胞亞群，CD4+CD25+Foxp3

2、+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)在腫瘤進(jìn)展中具有重要的意義，它促使腫瘤細(xì)胞免于機(jī)體免疫應(yīng)答，在胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中均表達(dá)上調(diào)。如何降低其對(duì)免疫應(yīng)答的抑制作用，使腫瘤生物免疫治療達(dá)到預(yù)期目的漸漸成為人們研究的熱點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于其下調(diào)與食管癌腫瘤免疫之間的研究尚少。本研究旨在通過腹腔移植建立荷人食管癌小鼠主動(dòng)免疫模型，尾靜脈注射CD25及Foxp3單克隆抗體后觀察Treg細(xì)胞的下調(diào)及其

3、對(duì)小鼠抗腫瘤免疫效應(yīng)的影響，以期為食管癌生物免疫治療提供相應(yīng)依據(jù)。
　　 方法:將新鮮的人食管癌組織移植于48只BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，隨機(jī)分為對(duì)照組、CD25單克隆抗體組、Foxp3單克隆抗體組及CD25與Foxp3聯(lián)合單克隆抗體組四組。對(duì)照組小鼠0.2mlPBS/只，CD25單抗組125ug/只，F(xiàn)oxp3單抗組50ug/只，聯(lián)合單抗組62.5ugCD25單抗+25ugFoxp3單抗/只，以上三組單抗均溶于0.2mlPBS中

4、后行尾靜脈注射，于瘤體移植前3天及移植后1天進(jìn)行。移植后2、4天各組處死2只小鼠，觀察瘤組織消長(zhǎng)情況、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況;移植后6天處死剩余小鼠，觀察小鼠一般情況、瘤塊消長(zhǎng)情況、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況、免疫器官指數(shù)、外周血Treg細(xì)胞表達(dá)情況、瘤組織Foxp3免疫組化染色強(qiáng)度等。分析Treg細(xì)胞下調(diào)情況及其對(duì)小鼠體內(nèi)特異性細(xì)胞免疫、移植瘤組織病理變化等的影響。應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行資料錄入分析，方差分析比較四組小鼠移植前體重

5、、移植瘤初始重及體積、處死時(shí)鼠重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、外周血Treg細(xì)胞表達(dá)之間的差異;多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較四組小鼠處死時(shí)瘤重及體積之間的差異;Fisher確切概率法、多個(gè)樣本率兩兩比較四組小鼠處死時(shí)移植瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度及Foxp3免疫組化染色強(qiáng)度之間差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多個(gè)樣本兩兩比較時(shí)，根據(jù)公式α(')=α/[k(k-1)]調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P＜α'表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

6、　 結(jié)果:
　　 1.各組小鼠至處死前一般狀況較好，移植前后小鼠體重各組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;
　　 2.各組小鼠外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例分別為（7.083±2.002）％、（1.934±1.186）％、（5.738±1.772）％及（3.772±1.120）％，CD25及聯(lián)合單抗處理組小鼠外周血中Treg細(xì)胞較低，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　 3.各組小鼠移

7、植時(shí)瘤組織重量及體積無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，處死時(shí)四組瘤組織均有不同程度的壞死，重量及體積較移植時(shí)均有所下降。抗體注射組小鼠移植瘤重量及體積均小于對(duì)照組，CD25單抗組小鼠人食管癌細(xì)胞很快受到排斥，在移植后第6天處死時(shí)瘤細(xì)胞可見度明顯下降，瘤重量及體積最小，而后依次是聯(lián)合單抗注射組、Foxp3單抗注射組;
　　 4.各組小鼠胸腺指數(shù)分別為（17.483±4.998）、（35.234±11.354）、（21.441±4.

8、754）及(28.512±7.015)10mg.g-1，脾臟指數(shù)分別為(32.547±10.824)、（47.083+12.133）、（34.618±12.153）及（41.897±18.905）10mg.g-1，兩個(gè)指標(biāo)各組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，CD25單抗、聯(lián)合單抗注射組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)oxp3單抗組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與CD25單抗組比較，F(xiàn)oxp3單抗、

9、聯(lián)合單抗組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著下降（其中，F(xiàn)oxp3&CD25單抗組P＜0.01，聯(lián)合&CD25單抗組P＜0.05）;而與Foxp3單抗組比較，聯(lián)合單抗組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著升高(P＜0.05);
　　 5.各組小鼠之間移植瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度差異有顯著性(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，CD25單抗及聯(lián)合單抗組小鼠瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度較高;Foxp3單抗組及聯(lián)合單抗組小鼠瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度不及CD25單抗組;聯(lián)合單抗組小

10、鼠瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度高于Foxp3單抗組。CD25及聯(lián)合單抗組小鼠移植后早期即出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著時(shí)間遷移，瘤細(xì)胞逐漸退變消失，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生逐漸增加;對(duì)照組、Foxp3單抗組小鼠早期移植瘤細(xì)胞異型性較高，出現(xiàn)淋巴浸潤(rùn)及瘤細(xì)胞壞死時(shí)間晚于上述兩組，纖維組織及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增生程度不及上述兩組。
　　 6.移植前留取相同瘤源患者的部分食管癌組織染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，F(xiàn)oxp3主要在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中表達(dá)。處死時(shí)

11、小鼠移植瘤組織Foxp3表達(dá)較移植前均下降，四組小鼠移植瘤組織中Foxp3的表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05)，對(duì)照組中，陽(yáng)性表達(dá)率為87.5％，其中弱陽(yáng)性表達(dá)(+)6例，中度陽(yáng)性表達(dá)(++)1例;CD25單抗組小鼠瘤組織中僅3例(37.5％)為弱陽(yáng)性表達(dá)，其余均為陰性表達(dá);Foxp3單抗組小鼠中，6例為弱陽(yáng)性表達(dá)(75％)，2例為陰性;聯(lián)合單抗組小鼠移植瘤組織陽(yáng)性及陰性表達(dá)各占50％。CD25單抗組Foxp3表達(dá)陽(yáng)性率最低，由此依次為聯(lián)

12、合單抗組、Foxp3單抗組及對(duì)照組，但分別比較時(shí)，對(duì)照組與Foxp3單抗組、CD25單抗組與聯(lián)合單抗組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:CD25單抗組小鼠至處死時(shí)外周血中Treg細(xì)胞水平最低，移植瘤壞死程度最高，體重及體積較之前減少最多，聯(lián)合單抗組次之，F(xiàn)oxp3單抗組小鼠Treg細(xì)胞比例與對(duì)照組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組小鼠瘤組織重量、體積下降程度也不及以上兩組。Treg細(xì)胞在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演了至關(guān)重要的角色，它的負(fù)