肌肉注射Ag85A DNA疫苗對膀胱癌小鼠T細胞亞群和NK細胞活性的影響.pdf

1、膀胱癌是我國泌尿外科最常見的惡性腫瘤，以淺表性膀胱癌多見。臨床治療中常在經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TURBT)后，用卡介苗(BCG)進行膀胱腔內(nèi)灌注來預防膀胱癌復發(fā)或治療原位癌，該法是目前最成功的免疫治療方法。但BCG灌注在多數(shù)患者中有無菌性膀胱炎、血尿、發(fā)熱等副作用，也有少部分患者對此法表現(xiàn)無反應性。因此，有必要研究開發(fā)BCG的有效成分用以替代BCG進行膀胱癌的治療。 Ag85復合物是BCG、結(jié)核分枝桿菌及其它分枝桿菌主要的外分泌

2、蛋白，由Ag85A、Ag85B和Ag85C三種蛋白分子組成，分子量為30～32kDa。以Ag85A為基礎(chǔ)制備的DNA疫苗在動物實驗中明顯上調(diào)了機體的細胞免疫應答水平。 細胞免疫是BCG抗膀胱癌免疫的主要機制。BCG灌注后可以募集單個核細胞浸潤至膀胱局部，其中CD4+T細胞主要通過釋放IL-2、IL-12和IFN-γ等細胞因子介導遲發(fā)型超敏反應(DTH)發(fā)揮抗腫瘤作用；CD8+T細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)等主要是通過

3、細胞殺傷作用發(fā)揮抗腫瘤效應。也有報道認為NK細胞在BCG介導的抗腫瘤免疫中作用更為重要。 本實驗將Ag85ADNA疫苗肌肉注射給荷MBT-2膀胱癌小鼠，觀察了該疫苗對小鼠T細胞亞群和NK細胞活性的影響，為確認單一應用Ag85ADNA疫苗是否能替代BCG用于膀胱癌治療提供實驗依據(jù)。 實驗材料與方法用堿裂解法從JM109菌中大量提取Ag85A-V1Jns.tpA質(zhì)粒和V1Jns.tpA質(zhì)粒，聚乙二醇法純化，0.8％瓊脂糖凝膠

4、電泳鑒定，調(diào)整濃度為1g/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?將1×106個MBT-2細胞接種于6-8周齡C3H/HeN雌性小鼠右側(cè)背部皮內(nèi)，待腫瘤直徑達約5-8mm時將動物隨機分成Ag5A-V1Jns.tPA組(實驗組)、V1Jns.tPA組(空質(zhì)粒組)和空白對照組(生理鹽水組)，于小鼠雙側(cè)股四頭肌肌肉注射共100μl(含100μg)質(zhì)?；蛳嗤萘康纳睇}水。每2周免疫一次，共三次。于末次免疫后2周，殺鼠制備脾細胞懸液，用FITC-CD4

5、熒光標記抗體和PE-CD8熒光標記抗體標記，經(jīng)流式細胞儀分析。同時用乳酸脫氫酶法測定NK細胞活性。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，用t檢驗進行顯著性分析。 實驗結(jié)果檢測各組小鼠脾細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群所占的百分比及CD4+/CD8+的比值，分別為：實驗組是8.91±6.27％、6.57±2.83％和1.26±0.34；空質(zhì)粒組是6.53±3.50％、5.20±1.37％和1.21±0.37；生理鹽水組是

6、11.94±3.74％、8.97±1.92％和1.31±0.23。各組間比較均未見顯著性差異(P＞0.05)。NK細胞活性分別是實驗組19.07±5.8％、空質(zhì)粒組11.16±10.01％和生理鹽水組22.06±6.02％，各組間也未見有顯著性差別(P＞0.05)。 討論在抗腫瘤免疫中，T細胞介導的細胞免疫占主導作用。由T細胞介導的細胞免疫主要是通過CD4+輔助性T細胞(Th1細胞)和CD8+細胞毒性T細胞(CTL)實現(xiàn)的。NK

7、細胞是機體天然免疫系統(tǒng)重要的抗腫瘤效應細胞，在BCG抗膀胱癌治療中發(fā)揮重要作用。 Ag85ADNA疫苗進入機體后可以激活抗原特異性的CTL和Th1型T細胞，二者均可釋放IL-2、IFN-γ等細胞因子，這些細胞因子可以進一步活化NK細胞。以上細胞和細胞因子均起到殺傷腫瘤細胞的作用。到目前為止尚未見有關(guān)單一應用Ag85ADNA疫苗對荷瘤動物，特別是膀胱癌動物治療效果及免疫功能變化方面的研究報道。我們應用單一的Ag85ADNA疫苗，其

8、表達產(chǎn)物可能不足以誘導荷瘤鼠免疫功能的提高，進而達到抗腫瘤的效果。 DNA疫苗的接種方法及途徑將影響其所含目的基因的表達、抗原的提呈及其誘導的免疫應答的類型。本研究中采用的是直接肌肉注射法，未見細胞免疫應答增強。這可能與動物的品系及所選用的接種方法和途徑有關(guān)。 因此，在應用DNA疫苗抗腫瘤的研究中，如何針對不同性質(zhì)的腫瘤選取有效的抗腫瘤候選基因制備DNA疫苗、選擇何種免疫方法和途徑，需進行多方面的綜合考慮。 結(jié)論