Ag85A DNA疫苗對膀胱癌荷瘤鼠淋巴細(xì)胞增殖能力和FasL mRNA表達(dá)水平的影響.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在男性常見腫瘤中居第四位，女性常見腫瘤中居第十位。膀胱癌90％以上為移行上皮細(xì)胞癌，有相當(dāng)一部分為淺表性膀胱癌。用卡介苗(BCG)進(jìn)行膀胱腔內(nèi)灌注來預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)或治療原位癌是至今最成功的免疫療法之一。但相當(dāng)數(shù)量的患者對BCG治療無效或在治療中產(chǎn)生副作用。因此有必要尋找一種更有效、更安全的制劑替代此種療法。 Ag85復(fù)合物主要由分子量為30-32kDa的Ag85A、Ag85B、Ag85C三種

2、蛋白質(zhì)組成，是結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白和BCG培養(yǎng)濾液的主要成分。其中Ag85A可能是細(xì)菌生長和維持毒力的最重要成分。用編碼Ag85A的DNA疫苗免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答和CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答，并能抵御經(jīng)氣溶膠或靜脈內(nèi)結(jié)核桿菌攻擊，提示編碼Ag85A的DNA免疫可誘生較結(jié)核桿菌感染更強(qiáng)烈、更廣泛的T細(xì)胞應(yīng)答。 本實驗通過給C3H/HeN小鼠皮內(nèi)接種MBT-2細(xì)胞建立移植性膀胱癌模型，再經(jīng)肌肉注射A

3、g85ADNA疫苗，探討該疫苗對荷瘤鼠T細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是對細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷活性的影響，為Ag85ADNA疫苗可否用于膀胱癌的治療提供實驗依據(jù)。 實驗材料和方法用堿裂解法從轉(zhuǎn)化后的JM109大腸桿菌中提取Ag85A-V1Jns.tpA質(zhì)粒和V1Jns.tpA質(zhì)粒，用BglⅡ限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。用堿裂解法大量提取質(zhì)粒后用聚乙二醇法純化質(zhì)粒，調(diào)整濃度為1g/L，保存在-20℃。 6-8周齡的C

4、3H/HeN雌性小鼠(18-20g)，隨機(jī)分成實驗組(Ag85A-V1Jns.tPA組)，空質(zhì)粒組(V1Jns.tPA組)和生理鹽水組三組，將1×106個MBT-2細(xì)胞接種于小鼠右側(cè)背部皮下，待腫瘤直徑長出約5-7mm后，于小鼠股四頭肌肌肉注射100μL濃度為1g/L的Ag85A-V1Jns.tPA，V1Jns.tPA或100μL的生理鹽水，每14天一次，重復(fù)3次。于末次免疫后第14天，殺鼠，迅速剝離背部腫瘤，去除腫瘤表面覆蓋的皮膚，逐

5、個稱取瘤重。無菌取脾，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖能力。并取1mL脾淋巴細(xì)胞懸液，用Trizol法提取脾淋巴細(xì)胞總mR-NA，用UV300紫外分光光度計測定總RNA純度及濃度。以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，以管家基因β-actin為內(nèi)參照，PCR擴(kuò)增小鼠FasL基因片斷。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠(EB)染色后，用ChemiImager5500凝膠圖像分析儀進(jìn)行掃描分析。Fas

6、LmRNA的表達(dá)水平用所測定的擴(kuò)增產(chǎn)物FasL的電泳條帶密度與β-actin電泳條帶密度的比值來表示。用t檢驗進(jìn)行顯著性分析。 實驗結(jié)果從JM109大腸桿菌中提取Ag85A-V1Jns.tPA質(zhì)粒和V1Jns.tPA空質(zhì)粒，用BglⅡ限制性內(nèi)切酶消化，然后經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后掃描后顯示，質(zhì)粒中存在Ag85A的基因片段(1014bp)。 末次免疫后第14天，Ag85ADNA質(zhì)粒組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)，

7、荷瘤鼠脾淋巴細(xì)胞FasLmRNA的表達(dá)水平以及瘤重與空質(zhì)粒對照組、正常對照組之間相互比較，均未見顯著性差異(p＞0.05)。 討論DNA疫苗指由編碼抗原的基因與啟動子和終止子組成的并能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的環(huán)狀DNA。DNA進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、分泌抗原，以類似自然感染的方式進(jìn)行抗原提呈，全面誘導(dǎo)特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在很多難治性感染性疾病，自身免疫性疾病，過敏性疾病和腫瘤性疾病的動物模型上，顯示了良好的預(yù)防和治療的前景。

8、 在我們的實驗中，肌肉注射Ag85ADNA疫苗后，未見脾細(xì)胞FasLmRNA的表達(dá)增加，MBT-2荷瘤鼠模型的脾淋巴細(xì)胞增殖能力也未見增強(qiáng)。此結(jié)果與各組移植瘤的生長情況相一致。這一結(jié)果提示，荷瘤鼠脾淋巴細(xì)胞未受到Ag85A抗原的足夠刺激，使其增殖能力增強(qiáng)。分析其原因可能為：按本研究的實驗方法經(jīng)肌肉注射Ag85ADNA疫苗，荷瘤鼠體內(nèi)未能產(chǎn)生足夠的蛋白表達(dá)量；單獨應(yīng)用Ag85ADNA疫苗所表達(dá)的Ag85A蛋白分子不能刺激免疫細(xì)胞功