電針耳穴對年齡相關性聾豚鼠聽覺中樞蛋白質(zhì)組影響的初步研究.pdf

1、 目的： 建立 D-半乳糖年齡相關性聾豚鼠模型,探討電針耳穴對 D-半乳糖所致的年齡相關性聾豚鼠聽覺中樞蛋白質(zhì)組的影響。方法：1. 分組及模型建立：成年豚鼠30只,按隨機數(shù)字表法分成三組：D-半乳糖模型組10只,D-半乳糖+電針組10只,對照組10只,18月齡豚鼠 10 只作為自然老化組。D-半乳糖模型組予以 D-半乳糖(300mg/kg·day)頸背部皮下注射,每天1次,共六周；對照組予以等量生理鹽水頸背部皮下注射,每天1次,連續(xù)6

2、周；D-半乳糖+電針組予以D-半乳糖(300mg/kg·day)頸背部皮下注射,每日1次,半小時后予以電針聽宮穴、翳風穴治療15分鐘,每日1次,連續(xù)6周。18 月齡組豚鼠常規(guī)飼養(yǎng)。2. 聽力學檢測：實驗結(jié)束后各組進行聽性腦干反應(Auditory brainstem response, ABR)和多頻穩(wěn)態(tài)誘發(fā)電位(Auditory steady state response, ASSR)檢測。3. 聽皮層蛋白質(zhì)組圖譜建立及差異蛋白的鑒定

3、：用常規(guī)細胞裂解法裂解細胞提取蛋白, Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。對照組、D-半乳糖模型組和D-半乳糖+電針組三組豚鼠聽皮層進行雙向電泳( Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)。第一向采用pH 4-7的固相pH梯度等電聚焦,第二向采用濃度為 10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。考染并照片獲得雙向電泳圖譜,篩選出10個具有差異表達的蛋白斑點。切取蛋白質(zhì)斑點,應用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間

4、質(zhì)譜技術( Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)進行檢測,獲得各蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜,結(jié)合2-DE圖譜中各蛋白質(zhì)點的等電點 ( Isoelectric point, PI )和分子量(Molecular weight, MW)值,利用Mascot軟件進行匹配檢索NCBI數(shù)據(jù)庫來鑒定蛋白質(zhì)。4.聽皮層及下丘兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶

5、(Catechol-0-methyltransferase, COMT)、β-鏈蛋白(β-catenin)表達的研究：采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)方法測定對照組、D-半乳糖模型組、D-半乳糖+電針組和 18 月齡組豚鼠聽皮層及下丘COMT、β-catenin蛋白表達變化情況。5. 統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0軟件進行分析,運用單因素方差分析檢驗,P<0.05具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：1. 體重變化：對照組、D-半乳糖模型組

6、和 D-半乳糖+電針組三組豚鼠實驗前體重、實驗后體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2. ABR閾值變化：聲強為132dB SPL、120 dB SPL時,各組ABR Ⅲ波潛伏期比較：對照組和D-半乳糖模型組、對照組和18月齡組、D-半乳糖+電針組和 D-半乳糖模型組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ,而 D-半乳糖模型組和 18 月齡組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3. ASSR閾值變化：比較各組ASSR閾值在1kHz、

7、2 kHz、4kHz時的變化,只有在4kHz時,對照組和D-半乳糖模型組之間差異有統(tǒng)計學意義( P<0.05 ) ,余各組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4. 聽皮層差異表達蛋白質(zhì)：灰度差異大于 2 倍以上的10個蛋白斑點鑒定出的蛋白質(zhì)分別是鳥嘌呤脫氨酶、ATP合酶β亞基、磷酸丙糖異構酶、肌酸激酶、丙酮酸脫氫酶E1復合體β亞基、α-烯醇化酶、磷酸甘油酸酯激酶-1、β-2A鏈樣微管蛋白等8種蛋白。5.聽皮層、下丘β-catenin

8、蛋白表達變化：豚鼠聽皮層、下丘β-catenin蛋白表達量在D-半乳糖模型和18月齡組下降,D-半乳糖+電針組表達量增加。對照組和D-半乳糖模型組、對照組和18月齡組、D-半乳糖+電針組和D-半乳糖模型組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而D-半乳糖模型組和18月齡組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。6.聽皮層、下丘 COMT 蛋白表達變化：(1)聽皮層：COMT 蛋白在D-半乳糖模型組和18月齡組表達降低,D-半乳糖+電針組表

9、達增加。對照組和D-半乳糖模型組、對照組和18月齡組、D-半乳糖+電針組和 D-半乳糖模型組之間 COMT 蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而D-半乳糖模型組和18月齡組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(2)下丘：COMT蛋白在D-半乳糖模型組和18月齡組表達降低,D-半乳糖+電針組表達增加。對照組和D-半乳糖模型組、對照組和18月齡組、D-半乳糖+電針組和D-半乳糖模型組之間COMT蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義( P<0.

10、05 )。結(jié)論：1. D-半乳糖300mg/kg·day頸背部皮下注射6周可以建立年齡相關性聾豚鼠模型。2. 電針聽宮穴、翳風穴能延緩豚鼠年齡相關性聾的發(fā)生。3. 鳥嘌呤脫氨酶等蛋白質(zhì)可能參與了 D-半乳糖致豚鼠年齡相關性聾的發(fā)生和發(fā)展過程,電針聽宮穴、翳風穴也可能通過調(diào)整以上蛋白質(zhì)的表達來延緩年齡相關性聾的發(fā)生和發(fā)展。4. β-catenin 蛋白可能通過Wnt/β-catenin信號通路,調(diào)控細胞生長、分化及凋亡,參與聽覺中樞的老化