FXR在膽汁酸超載引起肝適應(yīng)性增大中的作用研究.pdf

1、膽汁淤積是以膽汁流動(dòng)障礙為特點(diǎn)的一種臨床綜合征。膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)的滯留和超載是各種膽汁淤積的共同結(jié)果，其可引起肝細(xì)胞的凋亡或壞死，最終可導(dǎo)致肝硬化或其它終末期肝病。肝增大是膽汁酸超載時(shí)肝的一種保護(hù)性的適應(yīng)性反應(yīng)，但其發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚。類法尼醇X受體(farnesoidXreceptor，F(xiàn)XR)在肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸超載的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)XR激動(dòng)劑在膽汁淤積中的治療作用是目前研究的熱點(diǎn)。 本研究旨在探討FXR在膽汁

2、酸超載引起肝適應(yīng)性增大中的作用，以為FXR激動(dòng)劑用于膽汁淤積的治療提供新的理論依據(jù)，并以期在此基礎(chǔ)上找到新的治療靶點(diǎn)。 第1章鵝去氧膽酸(claenodeoxycholicacid，CDCA)通過激活FXR引起C57BL/6小鼠肝肥大 目的:探討膽汁酸CDCA引起的肝增大的組織學(xué)特點(diǎn)以及FXR在膽汁酸引起肝增大中的作用。 方法: 1.含1％CDCA的飼料和正常飼料(對(duì)照)分別喂養(yǎng)C57BL/6野生型小鼠和

3、FXR基因敲除小鼠(FXRknock-out，F(xiàn)XR-KO)8周，應(yīng)用HE染色和免疫組化方法觀察CDCA處理后小鼠肝的組織學(xué)變化。 2.應(yīng)用real-timePCR檢測(cè)CDCA處理后野生型和FXR-KO小鼠肝內(nèi)FXR的靶基因膽固醇7α羥化酶(cholesterol7α-hydroxylase，CYP7A1)mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果: 1.1％CDCA處理野生型小鼠8周后引起肝增大約50％(P<0.05)，HE染

4、色結(jié)果顯示肝細(xì)胞肥大的組織學(xué)特點(diǎn)。200倍視野下肝細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，CDCA處理組野生型小鼠肝細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較減少約20％(P<0.05)。然而，F(xiàn)XR-KO小鼠組織學(xué)檢查顯示自然發(fā)生的脂肪肝，CDCA處理后未引起肝細(xì)胞增大。針對(duì)細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67和cyclinD1的免疫組化顯示，陽(yáng)性細(xì)胞百分比在CDCA處理組和對(duì)照組沒有顯著性差異。針對(duì)5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine，BrdU)的免疫組化結(jié)果顯示

5、，在CDCA處理后肝細(xì)胞的陽(yáng)性率也未見明顯變化。 2.針對(duì)FXR靶基因CYP7A1的real-timePCR結(jié)果顯示，CDCA處理野生型小鼠后顯著抑制了肝內(nèi)CYP7A1mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而FXR-KO小鼠肝內(nèi)CYP7A1脫阻抑。 結(jié)論: 1.膽汁酸CDCA引起C57BL/6野生型小鼠肝細(xì)胞肥大。 2.FXR介導(dǎo)CDCA引起的肝細(xì)胞肥大。 第2章FXR激活引起肝肥大的分子機(jī)制的探討

6、 目的:探討FXR激活引起肝肥大的分子機(jī)制。 方法: 1.含1％CDCA的飼料和正常飼料分別喂養(yǎng)C57BL/6野生型小鼠和FXR-KO小鼠7天，觀察CDCA處理后小鼠肝的組織學(xué)變化。 2.應(yīng)用GeneChipRMouseGenome430A2.0Array基因芯片分析CDCA處理7天后野生型小鼠肝基因表達(dá)譜的變化，并從中挑選引起肝肥大的候選基因。 3.應(yīng)用real-timePCR對(duì)候選基因進(jìn)行確認(rèn)，并

7、應(yīng)用westernblotting檢測(cè)CDCA處理后HEX蛋白在野生型和FXR-KO小鼠肝內(nèi)的表達(dá)變化。 結(jié)果: 1.CDCA處理7天后引起野生型小鼠肝增大約17％(P<0.05)，而未見FXR-KO小鼠肝重的明顯變化。肝組織學(xué)檢查確認(rèn)了野生型小鼠的肝細(xì)胞肥大，但程度比CDCA處理8周后較輕。 2.基因芯片的結(jié)果顯示，CDCA處理后野生型小鼠肝內(nèi)分別約有200個(gè)基因上調(diào)或下調(diào)超過2倍，大部分基因與代謝、轉(zhuǎn)錄，信號(hào)

8、轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育有關(guān)。FXR的靶基因CYP7A1和甾醇12α-羥化酶(sterol12α-hydroxylase，CYPSB1)的表達(dá)在CDCA處理組明顯下調(diào)，證實(shí)了野生型小鼠肝內(nèi)FXR的激活。我們從基因芯片數(shù)據(jù)中挑選出可能介導(dǎo)FXR激活引起肝肥大的4個(gè)候選基因，造血表達(dá)同源異形盒(hematopoieticallyexpressedhomeobox，HEX)，促甲狀腺激素胚胎因子(thyrotrophicembryonicfactor，TE

9、F)，REV-ERBβ和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(insulin-likegrowthfactorbindingprotein1，IGFBP1)，其中HEX基因在肝的發(fā)育過程中引起細(xì)胞的形狀和體積改變。 3.應(yīng)用real-timePCR對(duì)這4個(gè)基因的檢測(cè)確認(rèn)了基因芯片的結(jié)果，其中CDCA對(duì)肝內(nèi)HEX的表達(dá)調(diào)節(jié)表現(xiàn)為FXR依賴性，而其他候選基因表現(xiàn)為FXR非依賴性。應(yīng)用westernblotting檢測(cè)HEX蛋白在小鼠肝內(nèi)的表達(dá)

10、后發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠肝內(nèi)HEX蛋白水平在CDCA處理7天和8周后表達(dá)明顯上調(diào)，而FXR-KO小鼠肝內(nèi)HEX的表達(dá)未見明顯變化。此外，realtimePCR結(jié)果顯示，野生型小鼠肝內(nèi)CYP7A1mRNA的表達(dá)在CDCA處理后明顯下調(diào)，而FXR-KO小鼠肝CYP7A1脫阻抑，進(jìn)一步證實(shí)了CDCA引起野生型小鼠肝內(nèi)FXR的激活。 結(jié)論: 1.肝內(nèi)HEX基因的表達(dá)上調(diào)依賴于FXR的激活。 2.HEX基因可能介導(dǎo)FXR激活引起

11、的肝細(xì)胞肥大。 第3章FXR通過結(jié)合HEX基因的第1內(nèi)含子上調(diào)該基因的表達(dá) 目的:探討肝細(xì)胞內(nèi)FXR對(duì)HEX基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 方法: 1.從野生型和FXR-KO小鼠中分離肝原代細(xì)胞，應(yīng)用100μMCDCA和/或1μM人工合成的FXR激動(dòng)劑GW4064處理離體肝細(xì)胞3小時(shí)和24小時(shí)，并用real-timePCR檢測(cè)HEXmRNA的表達(dá)變化。 2.應(yīng)用real-timePCR和westernbl

12、otting檢測(cè)HEX在人的肝癌細(xì)胞株HepG2和HuH7中的表達(dá)情況。遞增濃度的CDCA處HepG2和HuH7細(xì)胞8小時(shí)后用real-timePCR檢～UHEX和FXR的靶基因小異源二聚體配偶體(smallheterodimerpartner，SHP)mRNA的表達(dá)變化。 3.應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TRANSFACRProfessional分析HEX基因內(nèi)可能的FXR結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)mHepG2細(xì)胞和小鼠肝原代細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)HEX基因的

13、染色質(zhì)免疫沉淀(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)，目的區(qū)域?yàn)镠EX基因的遠(yuǎn)端(-1000/-500)和近端(-500/+1)啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1/exon1)以及第1和第3內(nèi)含子的保守區(qū)，100μMCDCA處理細(xì)胞24h后觀察FXR對(duì)HEX基因結(jié)合的變化。應(yīng)用EMSA和報(bào)道基因轉(zhuǎn)染以進(jìn)一步證實(shí)FXR通過結(jié)合HEX基因第1內(nèi)含子增強(qiáng)子類似區(qū)內(nèi)的IR-1類似元件以調(diào)控HEX基因。 結(jié)果:

14、 1.Real-timePCR結(jié)果顯示CDCA處理后野生型小鼠肝細(xì)胞內(nèi)HEX和SHP的mRNA水平升高2～3倍(處理3小時(shí)差異有顯著性，P<0.05)，然而FXR-KO小鼠肝細(xì)胞內(nèi)這兩個(gè)基因的mRNA水平未見明顯變化。 2.FXR蛋白和mRNA在HepG2細(xì)胞中大量表達(dá)，但在HuH7細(xì)胞中表達(dá)缺失，而HEXmRNA在HepG2和HuH7細(xì)胞中都存在表達(dá)。CDCA處理HepG2和HuH7細(xì)胞8小時(shí)后，real－timePCR

15、結(jié)果顯示HepG2中HEXmRNA表達(dá)呈CDCA濃度依賴性的增加，其中100μMCDCA處理后上調(diào)HEXmRNA水平2.2±0.2倍(P<0.01)。同時(shí)，F(xiàn)XR的靶基因SHPmRNA的表達(dá)也呈CDCA濃度依賴性的升高。然而，HuH7細(xì)胞中HEX和SHP的mRNA水平在CDCA處理后未見明顯變化。 3.我們應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TRANSFACRProfessional在HEX基因的第1內(nèi)含子保守區(qū)的增強(qiáng)子類似區(qū)鑒定出一個(gè)候選FXR

16、結(jié)合位點(diǎn)(IR-1類似元件)。CDCA處理HepG2細(xì)胞后，抗乙酰組蛋白H3抗體引起了HEX基因中的遠(yuǎn)端(-1000/-500)啟動(dòng)子區(qū)，第1和第3內(nèi)含子的保守區(qū)沉淀明顯增加，而瓊脂糖小球和對(duì)照抗體IgG作用后這些區(qū)域的沉淀未見明顯變化?？笷XR抗體引起了人HEX基因的第1和第3內(nèi)含子的保守區(qū)沉淀顯著增加，而對(duì)照抗體IgG未引起這些區(qū)域沉淀的明顯變化。CDCA處理離體小鼠肝細(xì)胞后，抗FXR抗體引起了野生型小鼠HEX基因的第1內(nèi)含子的保守