京尼平苷酸基于FXR抗ANIT誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠保肝利膽機制研究.pdf

1、目的:
　　膽汁淤積癥是現(xiàn)代臨床常見病種，其發(fā)病的機制極其復(fù)雜，臨床治療也缺乏行之有效的藥物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，清熱利濕中藥在抗膽汁淤積方面有其獨特的療效和優(yōu)勢，尤其以富含環(huán)烯醚萜類中藥見長，但其作用機制尚無明確定論，本文考察環(huán)烯醚萜化合物京尼平苷酸在保肝利膽作用的有效性和機制探究，為其進一步開發(fā)提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1.京尼平苷酸(GPA)純度測定及其小鼠體內(nèi)急性毒性實驗
　　建立HPLC法分析測定京尼

2、平苷酸純度以及在昆明種小鼠體內(nèi)進行急性毒性實驗并確定GPA的半數(shù)致死量(LD50)。死亡小鼠及時尸檢，觀察其主要器官組織有無異常，其余小鼠在觀察期結(jié)束后處死解剖，觀察其主要器官有無異常。給藥前及給藥后1周稱量小鼠體重，并進行比較。
　　2.GPA對α-萘異硫氰酸酯(ANIT)誘導(dǎo)大鼠肝內(nèi)膽汁淤積保肝利膽藥效及機制研究
　　第一組:空白對照組(1:Blank control):市售大豆油灌1mL/100gB.W./d連續(xù)灌胃7

3、天(d);
　　第二組:模型對照組（2:ANIT treated model）:第5天一次性灌胃ANIT65mg/kg，其余每天灌胃同空白對照組灌大豆油1mL/100gB.W./d;
　　第三組:陽性對照組(3:ANIT+100mg/kgB.W.UDA).灌胃熊去氧膽酸100mg/kg/d，連續(xù)灌胃7天，在第5天一次性灌胃ANIT65mg/kg;
　　第四組:京尼平苷酸高劑量組(4:ANIT+100mg/kgB.W.G

4、PA):灌胃京尼平苷酸100mg/kg，連續(xù)灌胃7天，在第5天一次性灌胃ANIT65mg/kg;
　　第五組:京尼平苷酸中劑量組(5:ANIT+50 mg/kgB.W.GPA):灌胃京尼平苷酸50mg/kg，連續(xù)灌胃7天，在第5天一次性灌胃ANIT65mg/kg;
　　第六組:京尼平苷酸低劑量組(6:ANIT+25mg/kg B.W.GPA):灌胃京尼平苷酸25mg/kg，連續(xù)灌胃7天，在第5天一次性灌胃ANIT65mg/k

5、g;
　　連續(xù)灌胃給藥7天，其中第5天除空白對照組外其它組灌胃給予ANIT(65mg/kg)一次。第7天末次給藥1h后，腹腔注射20％的烏拉坦麻醉，固定，進行膽總管插管手術(shù)，分段收集膽汁，腹主動脈取血，摘取肝臟，膽汁和肝重稱重，檢測膽汁中GSH/TB/DB/TBA以及血清GOT/GPT/γ-GT/TB/DB/TBA量或活性，H-E染色考察GPA對ANIT誘發(fā)大鼠的肝內(nèi)膽汁淤積的肝組織病理學(xué)觀察，免疫熒光雙染法，檢測肝組織中MRP2

6、/BSEP在組織中位置表達，Western Blot/RT-PCR法檢測GPA干預(yù)ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠的肝組織中MRP2/BSEP/FXR蛋白/基因表達。
　　3.GPA在正常和ANIT(100mg/kgB.W.)誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)比較分析
　　GPA一次灌胃給24只正常大鼠和24只ANIT膽汁淤積模型大鼠，各分為3組(高、中、低，GPA劑量為100，50，25mg/kg)，每組8只。建立HPLC-

7、UV法測定各組大鼠分別于給藥前，及藥后5，15，30min，以及1，2，3，4，6，8，12，24h時間點GPA血藥濃度，用PK solution2.0計算各組的藥動學(xué)參數(shù)。
　　Phenomenex C18(250mm×4.60mm，5μm)色譜柱;流動相:乙腈-0.5％冰醋酸(28:72);檢測波長:238nm;檢測15min;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10μL。
　　4.GPA對BRL-3A的細胞

8、活性及增殖測定
　　運用CCK-8法測定BRL-3A細胞分別按2000、4000、6000個/孔的細胞數(shù)量接種的生長曲線，根據(jù)細胞濃度和培養(yǎng)天數(shù)，確定最佳細胞種植密度。
　　用DMEM高糖培養(yǎng)基將GPA稀釋成濃度為500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.10mmol/L的含GPA培養(yǎng)基。細胞以4000個/孔的數(shù)量，重復(fù)5孔接種于96孔板，培養(yǎng)48h，依次加入上述濃度含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，用CCK-8檢測，根

9、據(jù)細胞存活率計算GPA對BRL-3A的IC50值。
　　5.GPA對BRL-3A大鼠肝細胞中FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表達水平的影響
　　將細胞分為正常對照組，GPA高、中、低劑量組加入終濃度為4、1、0.25mmol/L的GPA誘導(dǎo)48h，每組兩塊6孔板。48h后，收集蛋白和RNA樣本。WB和RT-PCR法檢測GPA干預(yù)BRL-3A大鼠肝細胞中MRP2/BSEP/FXR蛋白和基因表達
　　6.GPA對si

10、RNA FXR介導(dǎo)BRL-3A細胞FXR基因沉默后細胞中MRP2/BSEP蛋白和基因的表達
　　實驗分為正常組、陰性對照組、siRNA-FXR組、siRNA-FXR+GPA4mM組、siRNA-FXR+GPA1mM組、siFXR+GPA0.25mM組。轉(zhuǎn)染6h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)正常培養(yǎng)至24 h，24 h后在按各組分組情況按GPA的量相應(yīng)加入。WB和RT-PCR法法檢測GPA對siRNA-FXR轉(zhuǎn)染后細胞中FXR/MRP2/BSE

11、P的蛋白和基因水平的影響。
　　結(jié)果:
　　用一次灌胃65mg/kg的ANIT在給藥48 h后具有明顯的致膽汁淤積的效果;與空白對照組，ANIT誘導(dǎo)組明顯抑制膽汁流量(P＜0.01)，同時明顯降低了膽汁中TB/DB/TBA含量(P＜0.01)，顯著(P＜0.01)升高了血清中TB/DB/TBA的含量和GOT/GPT/γ-GT酶活性，肝組織病理圖顯示細胞水腫，重度的炎細胞浸潤，肝血竇內(nèi)有淤膽，有大量膽汁橫溢，膽管受損;與ANI

12、T誘導(dǎo)組比較，100mg/kg GPA高劑量組的膽汁流量顯著提高(P＜0.01)，膽汁中TB/DB/TBA/GSH的含量也顯著提高(P＜0.01)，而血清中TB/DB/TBA的含量和GOT/GPT/γ-GT酶活性顯著降低(P＜0.01)，肝組織病變程度較ANIT組顯著改善?？梢姡珿PA的作用與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，65mg/kg的ANIT的誘導(dǎo)能明顯抑制BSEP的表達;與ANIT模型誘導(dǎo)組比較，

13、在使用UDA和GPA保護的干預(yù)治療的大鼠肝組織中BSEP的表達區(qū)域明顯增加，且GPA的劑量高低對BSEP表達區(qū)域的增加也呈現(xiàn)明顯的劑量正相關(guān);然而，在免疫熒光雙染實驗中，細胞質(zhì)和胞漿中MRP2的表達，沒有明顯的表現(xiàn)出差異。WB和RT-PCR檢測表明，與空白對照組比較，65mg/kg的ANIT誘導(dǎo)的各組大鼠肝組織中FXR/MRP2/BSEP的蛋白和基因表達量極顯著性的降低(P＜0.01);而與ANIT誘導(dǎo)組，灌服熊去氧膽酸，F(xiàn)XR/MRP

14、2/BSEP的蛋白和基因表達水平有較明顯的提高(P＜0.01);用GPA給予7天的預(yù)防性治療，高劑量的GPA對FXR/MRP2/BSEP蛋白何人基因表現(xiàn)出極明顯的提高(P＜0.01)，中劑量的GPA也表現(xiàn)出明顯上調(diào)FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表達水平(P＜0.05)，GPA上調(diào)FXR/MRP2/BSEP蛋白水平的能力與其劑量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，25 mg/kg GPA的預(yù)防給藥與一次性給予65 mg/kg ANIT的模型誘導(dǎo)組比較

15、，在蛋白水平表達上未見明顯區(qū)別，而基因出明顯提高的效果(P＜0.05)。
　　BRL-3A細胞以4000個/孔數(shù)量，生長速度符合實驗要求。實驗時按125倍的96孔板細胞接種數(shù)量，接種于6孔板中，即5×105個/孔接種。GPA對BRL-3A細胞的半數(shù)抑制濃度IC50的測定，半數(shù)抑制率濃度，得到IC50=39.37mM，依據(jù)不大于十分之一的劑量作為給藥高劑量4mM，1mM為中劑量，0.25mM為低劑量。
　　WB和RT-PCR檢

16、測表明，F(xiàn)XR基因沉默后，與正常培養(yǎng)的BRL-3A細胞相比;轉(zhuǎn)染siRNA-FXR的細胞，其FXR的基因和蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.01)，MRP2和BSEP的基因和蛋白水平也顯著降低(P＜0.01);而與空白轉(zhuǎn)染組（陰性轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染了siRNA-Negative）組相比，轉(zhuǎn)染組的FXR、MRP2和BSEP的表達水平均降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而陰性轉(zhuǎn)染組與正常組相比，F(xiàn)XR的表達水平?jīng)]有差異(P＞0.05)。與轉(zhuǎn)染s

17、iRNA-FXR的各組細胞相比，siRNA-FXR+4mM GPA組、siRNA-FXR+1mM GPA組、siRNA-FXR+0.25mM GPA組中的FXR、MRP2和BSEP基因和蛋白水平，均有一定的提高，且呈劑量正相關(guān)，其中siRNA-FXR+4mM GPA組具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　京尼平苷酸對ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積模型大鼠具有保肝利膽藥效，結(jié)合體內(nèi)外研究及沉默F(xiàn)XR實驗發(fā)現(xiàn)，GPA的保肝利