腎臟近曲小管多巴胺D-,3-受體對內(nèi)皮素B受體的異常調(diào)節(jié)在原發(fā)性高血壓發(fā)病中的作用研究.pdf

1、一、研究背景 腎臟由于其對尿鈉重吸收的調(diào)節(jié)作用而在血壓調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在腎臟的各個部位中，腎臟近曲小管(RPT)的作用尤其引人注目。它可調(diào)控超濾液中約70％的Na+、Cl-和水、100％的葡萄糖和氨基酸。在RPT，由于上皮細胞基底膜的Na+-K+-ATP酶的作用，使小管液與胞漿之間的Na+維持一定的濃度階差，從而為水和鈉的重吸收提供了原動力。因此，在某些情況下，如果引起了Na+-K+-ATP酶的活性增強，意味著水和鈉的重吸收

2、增加，最終將導(dǎo)致機體水鈉潴留，血壓增高。 腎臟的尿鈉排泄受到多個神經(jīng)體液系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，多巴胺與內(nèi)皮素系統(tǒng)在調(diào)節(jié)水鹽平衡中的作用得到人們的重視。腎小管能夠分泌內(nèi)皮素(ET)，并且通過自分泌或旁分泌的形式參與調(diào)節(jié)離子的轉(zhuǎn)運。許多在體及離體實驗結(jié)果顯示內(nèi)皮素對水鈉重吸收的調(diào)節(jié)作用主要通過內(nèi)皮素B(ETB)受體。在腎髓質(zhì)，刺激ETB受體可通過抑制集合管的離子轉(zhuǎn)運，從而達到調(diào)節(jié)水鹽代謝的目的；然而，對于ETB受體在RPT段的作用卻有不同的報

3、道，短時間刺激OK(負鼠腎臟)細胞ETB受體可激活氫鈉交換體-3(NHE3)的活性；長時間(6小時)刺激則抑制其表達及功能。我們的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)ETB受體在RPT處表達豐富，因Na+-K+-ATP酶為此處水鈉重吸收的原動力，我們推測該受體在RPT段可能通過對Na+-K+-ATP酶活性的影響，發(fā)揮著對離子轉(zhuǎn)運的調(diào)控作用。 多巴胺受體分為D1-樣(D1、D5)和D2-樣(D2、D3、D4)兩類受體亞型。以往研究發(fā)現(xiàn)D1受體可通過排鈉利尿

4、、擴張血管作用發(fā)揮對血壓的調(diào)節(jié)功能。然而，人們對D2-樣受體的研究尚少。D3受體為D2-樣受體中主要的受體亞型，且D3受體在RPT的表達占主導(dǎo)地位。我們的初步研究顯示多巴胺D3受體基因敲除小鼠的尿鈉排泄功能障礙，伴有腎臟ETB受體的表達量減低，提示D3受體與ETB受體的相互作用可能在尿鈉排泄中發(fā)揮一定的作用。鑒于自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)RPT處D3受體介導(dǎo)的尿鈉排泄功能受損，我們推測在高血壓狀態(tài)下，D3受體與ETB受體間的交互作用同樣

5、存在受損現(xiàn)象，D3受體對ETB受體的異常調(diào)節(jié)可能參與了高血壓的發(fā)病機制。我們將主要從細胞水平對此進行研究，此問題的解決對于完善原發(fā)性高血壓(EH)的發(fā)病機制將會有一定的幫助，并為尋找有效的EH防治措施提供一種新的思路。 二、研究目的 1、明確D3和ETB受體在RPT細胞上的表達。 2、通過對Na+-K+-ATP酶活性的研究，觀察ETB受體在腎臟RPT處對離子轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)功能，并深入尋找介導(dǎo)這一調(diào)節(jié)效應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

6、。 3、研究D3受體對ETB受體的表達及功能的影響，探討該調(diào)節(jié)作用在WKY(Wistar-Kyoto)及SHR大鼠上的區(qū)別，探索D3受體對ETB受體的異常調(diào)節(jié)在EH發(fā)生中的作用。 三、研究方法 1、本實驗以WKY及SHR大鼠的RPT細胞株作為研究對象，采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察D3和ETB受體在RPT細胞上的表達情況。 2、以WKY大鼠的RPT細胞作為研究對象，觀察刺激ETB受體對Na+-K+-ATP酶

7、活性的影響，并觀察在預(yù)先阻斷蛋白激酶A(PKA)(PKA阻斷劑14-22)、PKC(PKC阻斷劑19-31)和Ca2+通道(Ca2+通道拮抗劑尼卡地平)的情況下ETB受體對Na+-K+-ATP酶活性影響的變化，探討ETB受體作用的信號途徑。 3、繼續(xù)以RPT上皮細胞株為研究對象，觀察刺激D3受體后ETB受體蛋白表達和功能的變化，D3受體蛋白表達的測定采用WesternBlot法；ETB受體調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運功能的檢測以其對Na+-K+

8、-ATP酶活性的影響來反映，Na+-K+-ATP酶的活性測定采用哇巴因法檢測單位時間內(nèi)無機磷的產(chǎn)量。然后再進一步觀察這一調(diào)節(jié)作用在SHR大鼠的RPT細胞上有無異常。 四、研究結(jié)果 1、D3和ETB受體在RPT細胞上均有豐富的表達，兩種受體在RPT細胞上共存現(xiàn)象明顯；但在SHR細胞這一共存程度明顯降低。 2、刺激ETB受體能夠明顯降低Na+-K+-ATP酶的活性，這一抑制作用呈濃度和時間依賴性，BQ302010-8

9、M刺激15min達最大效應(yīng)，下降幅度約36.1％；進一步研究發(fā)現(xiàn)，這一效應(yīng)的發(fā)生與細胞外鈣離子內(nèi)流有關(guān)，ETB受體與其特異性激動劑BQ3020結(jié)合后，經(jīng)Gq激活細胞膜鈣通道，使細胞外鈣內(nèi)流，進而激活PI3K-IP3-[Ca2+]i信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而發(fā)揮抑制Na+-K+-ATP酶活性的作用。 3、刺激D3受體增加WKY大鼠RPT細胞ETB受體的表達，卻抑制SHR大鼠ETB受體的表達。用ETB受體激動劑BQ3020(10-8M/15

10、min)刺激ETB受體可明顯降低WKY大鼠RPT細胞的Na+-K+-ATP酶的活性，但在SHR的RPT細胞，這種抑制作用卻喪失；基礎(chǔ)狀態(tài)下SHR的Na+-K+-ATP酶活性明顯高于WKY大鼠。單獨應(yīng)用D3受體激動劑對Na+-K+-ATP酶活性無影響，預(yù)先刺激D3受體(PD128907，10-7M/24hrs)均可使ETB受體對Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用進一步加強，但這種加強作用在SHR細胞明顯弱于WKY細胞。 五、結(jié)論