qPCR快速檢測(cè)桃枝干組織病原菌Botryosphaeria dothidea.pdf

1、桃樹(shù)流膠病是桃樹(shù)重要病害之一，主要危害主干、主枝以及側(cè)枝，會(huì)嚴(yán)重削弱樹(shù)勢(shì)，影響樹(shù)體健康，進(jìn)而可能影響果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，當(dāng)病害嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)造成枯枝死樹(shù)。前人研究發(fā)現(xiàn)湖北省桃流膠病菌鑒定為Botryosphaeria dothidea，B.obtuse，B.rhodina。其中B.dothidea分離頻率最高，分布最廣泛;B.rhodina僅在沙洋縣發(fā)現(xiàn);B.obtusa在公安縣有分布。B.dothidea被確定為主要的桃流膠病菌。目前缺少快

2、捷、可靠的桃流膠病病原菌檢測(cè)方法，本課題通過(guò)設(shè)計(jì)具有B.dothidea種特異性的引物，以期構(gòu)建出可靠的qPCR方法檢測(cè)病部組織的病原菌DNA含量。主要研究結(jié)果如下:
　　1.本研究找到一種適合桃枝干病部組織DNA提取的方法。該方法以改良CTAB法為基礎(chǔ)，在提取DNA時(shí)使用組織磨樣機(jī)代替人工液氮磨樣，提高了提取效率。其次，在水浴樣品30 min后增加離心收集上清液這一步驟。對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)以及PCR抑制物檢測(cè)，結(jié)果顯示D

3、NA質(zhì)量較高，不含有PCR抑制物。
　　2.設(shè)計(jì)出B.dothidea的種特異性引物。根據(jù)桃流膠病菌B.dothidea、B.rhodina、B.obtusa菌株和Genbank中收錄的Botryosphaeria spp.菌株的β-tubulin序列進(jìn)行比對(duì)，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)種特異性引物對(duì)EF1/ER2。正向引物EF1:5'-TCATTCTCAGCGTGGGAGAACA-3';反向引物ER2:5'-

4、ACGAGGAACGTACTTGTTGTTGGA-3'將設(shè)計(jì)的種特異性引物導(dǎo)入GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)引物沒(méi)有產(chǎn)生任何非特異性擴(kuò)增以及其他物種的相似性較高的序列。使用B.dothidea菌株、Botryosphaeria spp.真菌菌株以及桃樹(shù)上常見(jiàn)的桃褐腐病菌、桃灰霉病菌、桃炭疽病菌等菌株檢測(cè)引物特異性，普通PCR和qPCR兩種技術(shù)均證明該引物具有特異性。田間樣品的qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增子序列和引

5、物設(shè)計(jì)序列完全一致，進(jìn)一步證明了qPCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性。對(duì)B.dothidea菌株WH-2的DNA樣品進(jìn)行梯度稀釋，同時(shí)進(jìn)行qPCR和普通PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)qPCR檢測(cè)的靈敏度為1 pg。普通PCR檢測(cè)的靈敏度為10 pg。qPCR檢測(cè)的靈敏度是普通PCR的10倍。
　　3.建立Ct與枝干組織中病原菌初始量的線性關(guān)系。線性回歸方程為y=-3.086x+24.7，判定系數(shù)R2為0.9943。選用寄主桃TEF2基因((Translatio