可視化LAMP法等溫快速檢測病原菌與恒溫紙質(zhì)微流體芯片構(gòu)建的研究.pdf

1、病原菌的快速檢測和準(zhǔn)確鑒定在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測，生物戰(zhàn)，食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測中是非常重要的。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定微生物學(xué)方法包括選擇性培養(yǎng)，生物化學(xué)和血清特性檢測等。這些傳統(tǒng)的方法幾乎完全依賴于使用特定的瓊脂培養(yǎng)基分離和挑選活的病原細(xì)菌。在實(shí)驗(yàn)室中最常用的鑒定方法是培養(yǎng)，進(jìn)而基于微生物的表型和生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。然而，這些用于細(xì)菌分析的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需要幾天或幾周才能提供準(zhǔn)確的結(jié)果。
　　事實(shí)上，在過去的幾十年里，許多快速的方法被開發(fā)來減少檢

2、測時(shí)間。到目前為止，快速的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，側(cè)流免疫測定法和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等，其檢測時(shí)間可以減少到10-24 h和4-6 h，靈敏度可以達(dá)到102-106 cfu/ml。然而，這些測試需要成本較高的儀器和熟練的專業(yè)操作人員，進(jìn)而限制了其廣泛應(yīng)用，特別是在發(fā)展中國家和地區(qū)。在現(xiàn)場檢測(Po

3、int-of-Care Test，POCT)及基層普及使用中它們不是最優(yōu)的選擇。因此發(fā)展使用一種快速、簡單和高特異性的檢測新技術(shù)對于病原微生物的檢測診斷具有重要的臨床意義。
　　核酸的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要特點(diǎn)是核酸擴(kuò)增從開始到結(jié)束都是在一個(gè)恒定的溫度下進(jìn)行。與普通PCR相比，它降低了溫控設(shè)備的成本，只需要一個(gè)普通的恒溫裝置，同時(shí)也減少了反應(yīng)的步驟和時(shí)間。因此在POCT診斷中，核酸恒溫?cái)U(kuò)增比普通PCR更適合。在當(dāng)前核酸的等溫?cái)U(kuò)增方法中，

4、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)法是一種結(jié)果較穩(wěn)定的方法，利用一種Bst DNA聚合酶和特異引物在溫度不變(65℃左右)和較短時(shí)間(30-60min)的條件下即可對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，并且擁有較高的靈敏性和特異性。此外，它只需要一個(gè)恒溫裝置，從而使檢測的費(fèi)用明顯減少。所以，本課題使用LAMP技術(shù)構(gòu)建一種簡單、快速的病原菌核酸檢測法。
　　早在1990年，Manz

5、A和Widmer團(tuán)隊(duì)首次指出在一塊以平方厘米為單位的小芯片上進(jìn)行樣品制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測分析的微流體芯片技術(shù)。其擁有高效率、低損耗（包括檢測用時(shí)、標(biāo)本量、試劑量），分析微型化和高通量化等特點(diǎn)，并且通過結(jié)合傳感或樣品前處理模塊，為以后的現(xiàn)場檢測帶來了方便。
　　紙質(zhì)材料，有著來源豐富、價(jià)格低廉、可循環(huán)、不易變性、易處理、易運(yùn)送、易化學(xué)修飾、以及與生物具有較好的相容性等特點(diǎn)，和現(xiàn)代印刷技術(shù)相結(jié)合可以制備出集分離、分析和檢測一體的微

6、流體裝置。然而目前市場上的紙質(zhì)微流體芯片主要用來檢測免疫蛋白而在核酸檢測上使用較少。其可能的原因是由于核酸普通PCR擴(kuò)增需要循環(huán)的變化溫度，因而在紙芯片上操作存在一定難度，限制了它的使用。本課題旨在探索在紙質(zhì)微流體芯片上進(jìn)行LAMP等溫?cái)U(kuò)增并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，提高紙質(zhì)微流體芯片在現(xiàn)場診斷中的使用價(jià)值。
　　目的:
　　本項(xiàng)目擬充分整合LAMP技術(shù)和紙質(zhì)微流體芯片技術(shù)的特色與優(yōu)勢，設(shè)計(jì)和構(gòu)建LAMP-紙質(zhì)微流體芯片，基于LA

7、MP法構(gòu)建一種快速、簡單的病原菌檢測方法，便于現(xiàn)場或野外的早期診斷和早期治療。
　　方法:
　　1.病原微生物及其耐藥基因的可視化LAMP快速檢測的構(gòu)建。
　　1)以銅綠假單胞菌為首的病原微生物收集，并對亞胺培南耐藥性進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。
　　2)采用簡易水煮法快速提取DNA。
　　3)針對銅綠假單胞菌的OprL和OprD2基因設(shè)計(jì)LAMP引物。
　　4)可視化LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)建。
　　5)可視化

8、LAMP檢測的特異性和靈敏性分析。
　　6)臨床標(biāo)本的檢測。
　　7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析OprD2陰性和陽性菌株與亞胺培南的耐藥性之間的差異。
　　2.用于等溫?cái)U(kuò)增核酸的紙質(zhì)微流體芯片的設(shè)計(jì)和制作。
　　1)在生物活性紙片上對病原微生物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測。
　　2)用于等溫?cái)U(kuò)增核酸的紙質(zhì)微流體芯片的設(shè)計(jì)。
　　3)選用whatm an＃1濾紙進(jìn)行紙質(zhì)微流體芯片手工簡易制作。
　　4)使用場發(fā)射掃描電鏡

9、對制作的紙質(zhì)微流體芯片的微觀結(jié)構(gòu)觀察。
　　3.基于鏈霉親和素-生物素化LAMP體系的構(gòu)建和條件的優(yōu)化。
　　1)基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)建:根據(jù)生物素和鏈霉親和素的共價(jià)偶聯(lián)作用，將生物素化的LAMP產(chǎn)物固定在由納米金標(biāo)記鏈霉親和素的紙芯片表面。
　　2)利用熒光定量PCR儀對其反應(yīng)體系中最佳溫度，時(shí)間，dNTPs濃度，BstDNA大片段聚合酶濃度，MgSO4濃度，Betaine濃度以及內(nèi)外引物濃度

10、進(jìn)行選擇和優(yōu)化。
　　3)利用熒光定量PCR儀對基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應(yīng)的靈敏性和特異性進(jìn)行分析。
　　4)臨床分離株的檢測。
　　結(jié)果:
　　1.成功的簡化了提取病原微生物DNA的操作，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。并且成功構(gòu)建了一個(gè)快速、靈敏、簡便的檢測耐亞胺培南銅綠假單胞菌的OprL和OprD2基因的可視化LAMP法。其特異性好，靈敏度(17.41μg/L)比傳統(tǒng)PCR高10倍。以傳統(tǒng)方法（細(xì)菌培養(yǎng)，VITE

11、K2系統(tǒng)，瓊脂稀釋法）為金標(biāo)準(zhǔn)，對臨床標(biāo)本OprL和OprD2基因同時(shí)進(jìn)行可視化LAMP法和常規(guī)PCR法檢測。對OprL基因，可視化LAMP法檢測的靈敏性和特異性都為100％，普通PCR法分別為94.9％和87％。對OprD2基因，可視化LAMP法檢測的靈敏性和特異性分別為75％和737％，普通PCR法分別為70％和73.7％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，OprD2陽性和OprD2陰性菌株對亞胺培南耐藥菌株具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P＜0.05)。

12、　　2.以銅綠假單胞菌為例，成功的在紙片上對其核酸DNA進(jìn)行了LAMP擴(kuò)增。
　　3.成功的對核酸等溫?cái)U(kuò)增的紙質(zhì)微流體的設(shè)計(jì)和簡易的制作。獲得國家的實(shí)用新型專利（用于等溫?cái)U(kuò)增核酸的紙質(zhì)微流體，ZL201420583698.X），國家的發(fā)明專利(一種利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，201410528335.0)。
　　4.成功的構(gòu)建了基于鏈霉親和素-生物素化LAMP反應(yīng)體系，為下一步在微流體芯片上固定和信號放大檢測墊定了

13、扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。并對其LAMP反應(yīng)體系條件進(jìn)行了優(yōu)化:得到最佳反應(yīng)擴(kuò)增的溫度為65℃，反應(yīng)擴(kuò)增時(shí)間為40min，反應(yīng)液中MgSO4最佳濃度為6 mM，BstDNA聚合酶濃度為0.32U/μl、dNTPs混合液的工作濃度為1.2mM，b-FIP/BIP內(nèi)引物濃度最佳濃度為1.6μM， F3/B3外引物最佳濃度為0.4μM，Betaine韻最佳濃度為0.6mM。以銅綠假單胞菌為例，基于鏈霉親和素-生物化LAMP法使用熒光定量PCR儀檢測分析

14、，其特異性好，靈敏度(0.402μg/L)比可視化LAMP法高100倍，比普通PCR高1000倍。使用該方法檢測銅綠假單胞菌的臨床分離株，其檢出率與可視化LAMP法相當(dāng)(14/14，100％)，而常規(guī)PCR法(13/14，93％)。
　　結(jié)論:
　　1.可視化LAMP法用于快速檢測病原微生物及其耐藥基因具有檢測時(shí)間短、過程簡單、靈敏度和特異性高、反應(yīng)結(jié)果肉眼可辨等特點(diǎn)。本課題以銅綠假單胞菌OprL和OprD2基因?yàn)槔?，成功?/p>

15、立了可視化LAMP檢測技術(shù)，使檢測結(jié)果的識別更容易。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示在亞胺培南耐藥方面，OprD2陰性菌株具有更高的風(fēng)險(xiǎn)。早期識別OprL和OprD2基因?qū)⒂兄谖覀兏玫貙RPA感染選擇抗生素治療方案，這將降低成本和時(shí)間。這種診斷方法更適合用于現(xiàn)場和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的使用。
　　2.微流體芯片技術(shù)是指在一塊以平方厘米為單位的小芯片上進(jìn)行樣品制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測分析的技術(shù)。其擁有高效率、低損耗（包括檢測用時(shí)、標(biāo)本量、試劑量），分析