重組Gax腺病毒對(duì)IGF-1干預(yù)大鼠脂肪細(xì)胞通道蛋白FAK,PYK2的影響.pdf

1、研究目的：
　　 脂肪組織不僅是儲(chǔ)能組織，脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，與糖尿病，高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化，炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)具有類胰島素樣作用，是生長(zhǎng)因子促進(jìn)因子，影響多種細(xì)胞的增殖，生長(zhǎng)及分化。同樣，IGF-1調(diào)控脂肪細(xì)胞的行為，影響脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期，在脂肪細(xì)胞增殖中作為必須的因子調(diào)控細(xì)胞周期G1期至S期。黏著斑激酶(FAK)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生物學(xué)行為，與其家族成員一起作為

2、細(xì)胞多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐發(fā)揮重要作用。尤其是它們中的PYK2是調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的中心。IGF-1能加快細(xì)胞移動(dòng)、FAK磷酸化，并能激活PYK2調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附。Gax基因具有抑制細(xì)胞遷移，增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。Gax可干預(yù)細(xì)胞的周期，使有絲分裂的細(xì)胞停止于G1期，這與IGF-1作用相反。但目前關(guān)于Gax能否抑制IGF-1干預(yù)的脂肪細(xì)胞通道蛋白FAK，PYK2尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)其進(jìn)行闡述。
　　 研究方法：
　　 1.將

3、目的基因GAX從原始質(zhì)粒上切下，與腺病毒載體重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒，鑒定正確后，純化擴(kuò)增腺病毒。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)用3-4代3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)，直到接觸抑制后2天后用地塞米松，IBMX及胰島素等培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，11天左右脂肪細(xì)胞出現(xiàn)大量脂滴。用油紅O染色鑒定90％以上脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組
　　 (1)按是否含Gax病毒分組:用含Gax的腺病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，分為空白對(duì)照組，

4、Ad-GFP組，Ad-Gax組，干預(yù)時(shí)間為48h。
　　 (2)按IGF-1的干預(yù)及Gax腺病毒的轉(zhuǎn)染分組:分為空白對(duì)照組，Ad-GFP組，Ad-Gax組，IGF-1＋Ad-Gax組，Ad-GFP＋I(xiàn)GF-1組，各組干預(yù)時(shí)間均為48h。
　　 4.蛋白免疫印記技術(shù)按是否含Gax病毒分組，觀察48h后脂肪細(xì)胞Gax的蛋白表達(dá)情況。按IGF-1和Gax轉(zhuǎn)染分組，觀察各組48h后脂肪細(xì)胞FAK，PYK2的蛋白表達(dá)情況。

5、　　 5.實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)IGF-1及Gax干預(yù)48h后脂肪細(xì)胞FAK，PYK2的mRNA相對(duì)表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實(shí)Gax基因成功插入到目的載體上，獲得重組腺病毒。
　　 2.脂肪細(xì)胞鑒定:用第3-4代3T3-L1前體脂肪細(xì)胞接觸抑制2天后誘導(dǎo)分化，第5天左右出現(xiàn)脂滴，第11天左右90％脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴，經(jīng)油紅O染色證實(shí)為脂肪細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。
　　 3.病毒轉(zhuǎn)染

6、:重組Gax腺病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，48h后行倒置熒光顯微鏡觀察，90％脂肪細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光。
　　 4.蛋白表達(dá):病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞48h后，Ad-Gax組與空白對(duì)照組，Ad-GFP組相比較，Gax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.01)，Ad-GFP與空白對(duì)照組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。IGF-1及病毒干預(yù)脂肪細(xì)胞48h后，Ad-GFP＋I(xiàn)GF-1組FAK，PYK2較空白對(duì)照組，Ad-GFP組，Ad-Gax組，Ad-Gax＋

7、IGF-1組比較蛋白表達(dá)水平顯著增加(p＜0.01)，Ad-Gax組與Ad-Gax＋I(xiàn)GF-1組FAK，PYK2較空白對(duì)照組，Ad-GFP組，Ad-GFP＋I(xiàn)GF-1組比較蛋白表達(dá)水平顯著減少(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-GFP組較空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 5.mRNA表達(dá):IGF-1及腺病毒干預(yù)脂肪細(xì)胞48h后，Ad-GFP＋I(xiàn)GF-1組FAK，PYK2的mRNA相對(duì)表達(dá)較空白對(duì)照組，

8、Ad-GFP組，Ad-Gax組，Ad-Gax＋I(xiàn)GF-1組顯著增加(p＜0.01)，Ad-Gax組與Ad-Gax＋I(xiàn)GF-1組FAK，PYK2的mRNA相對(duì)表達(dá)較空白對(duì)照組，Ad-GFP組，Ad-GFP＋I(xiàn)GF-1組比較顯著減少(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-GFP組較空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠Gax基因能有效轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，并且在脂肪細(xì)胞中表達(dá)。
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