姜黃素納米粒(NanoCurcTM)聯合索拉非尼對肝細胞癌生物學特性的協同作用及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、原發(fā)性肝癌發(fā)病率位列全世界第五、我國第三的惡性腫瘤。根據世界衛(wèi)生組織預計,在2030年前,肝癌都將保持持續(xù)增長,其病死率更是高居第二位[1]。近幾年,腫瘤治療雖然取得了長足進步,諸如手術、介入、肝移植等方法的采用,但肝癌總體5年生存率仍僅15%[2,3]。超過60%的肝癌患者在初次就診時已經進入中晚期并伴有轉移、復發(fā),從而失去手術治療的機會。因此,抗腫瘤藥物的研究顯得極為重要,成為進一步提高肝癌生存率的關鍵。
  腫瘤的發(fā)生發(fā)展、

2、侵襲轉移是一個多步驟的復雜動態(tài)過程?;瘜W治療因其自身優(yōu)點受到越來越多的重視,對抗腫瘤轉移效果好且副作用小藥物的需求更是不斷增加。越來越多的研究將目光投向天然產物。天然產物已經成為抗癌藥物的重要來源,約70%抗腫瘤藥物提取自天然產物[4]。此外,聯合用藥方案具有提高抗腫瘤療效、延緩耐藥性的產生,而毒性增加不多的優(yōu)點,為抗腫瘤提供了新的對策。
  本研究主要探討姜黃素納米粒(NanoCurcTM,NC)聯合索拉非尼對肝細胞癌生物學特性

3、的影響。采用體外細胞增殖檢測試劑盒(CCK-8),體外劃痕實驗和Transwell侵襲實驗法檢測NC聯合索拉非尼對人肝癌細胞生長增殖、遷移、侵襲能力的影響。隨后應用流式細胞術分析對細胞周期、凋亡的作用。建立MHCCLM3-RFP裸鼠皮下成瘤和原位成瘤模型并觀察NC聯合索拉非尼對腫瘤大小、肺轉移率的影響。最后探討NC和/索拉非尼抗腫瘤效應的可能機制,為防治肝癌提供新的可能藥物。
  第一部分 NC聯合索拉非尼對人肝癌細胞生物學特性的

4、影響
  本研究旨在通過肝癌細胞系Huh7和MHCCLM3體外實驗,探索NC和/或索拉非尼對腫瘤細胞生長、遷移、侵襲以及細胞周期、細胞凋亡等生物學行為的影響。
  利用NC和/或索拉非尼藥物對Huh7和MHCCLM3細胞系進行處理。隨后采用體外細胞增殖檢測試劑盒(CCK-8)檢測NC和/或索拉非尼處理前后細胞增殖能力的變化;劃痕實驗檢測遷移能力的變化;Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力的改變。進一步通過流式細胞術分析

5、對細胞凋亡及細胞周期的影響。
  結果顯示,NC和/或索拉非尼處理后,肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力都顯著降低,且NC和/或索拉非尼對肝癌細胞增殖遷移抑制能力相似(P<0.01)。然而,NC和索拉非尼聯合應用對肝癌細胞侵襲能力的抑制作用顯著優(yōu)于NC或索拉非尼單獨處理后(P<0.05)。流式細胞術實驗結果與細胞增殖實驗相一致,NC和/或索拉非尼可顯著升高肝癌細胞早、晚期凋亡及壞死細胞比例,而NC和索拉非尼聯合應用對壞死細胞增高程度顯

6、著優(yōu)于NC或索拉非尼單獨處理后。與NC或索拉非尼單獨處理相比,聯合處理后G2/M期細胞比例顯著增高(P<0.01)。
  以上結果表明,NC聯合索拉非尼能夠協同抑制肝癌細胞增殖,降低遷移和侵襲能力,增加細胞早、晚期凋亡及壞死比例。對細胞的抑制增殖作用與G2/M期阻滯相關。
  第二部分 NC聯合索拉非尼對肝癌裸鼠模型生物學特性的影響
  本研究旨在通過建立肝癌原位和皮下小鼠模型,探索NC和/或索拉非尼在體內實驗中對腫瘤

7、細胞生長以及轉移等生物學行為的影響。
  通過建立人高轉移MHCCLM3-RFP皮下和原位移植瘤模型,研究NC和/或索拉非尼給藥與否對腫瘤大小的影響。獲取新鮮肺組織,通過熒光成像顯微鏡觀察肺組織中的轉移灶(轉移灶為標記RFP的腫瘤組織),并通過H&E染色確定肺轉移情況。
  結果顯示,4周后NC組、索拉非尼組、聯合組和對照組(給予PBS)的原位腫瘤大小有顯著性差異,分別為(0.75±0.14) cm3 vs(0.50±0.1

8、1)cm3 vs(0.45±0.09) cm3 vs(1.26±0.13) cm3;肺轉移率分別為50.0%,66.7%,16.7%,100%。
  體內實驗表明,NC和索拉非尼聯合應用能夠抑制肝癌生長,減少肺轉移的數目。
  第三部分 NC聯合索拉非尼對肝細胞癌生物學特性影響機制的研究
  為了探討NC聯合索拉非尼抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的內在機制,本研究從信號通路和肝癌干細胞兩方面入手。一方面,NC與索拉非尼聯

9、合應用可協同抑制ERK磷酸化,減少NF-kB/p65 DNA結合,從而下調MMP-9的表達,進而發(fā)揮抗腫瘤轉移的作用。另一方面,NC與索拉非尼聯合也能協同抑制肝癌干細胞——CD133+肝癌細胞的數量。
  首先對Huh7及MHCCLM3細胞系進行研究,借助RT-PCR、ELISA、Westernblot從蛋白質、RNA層面對ERK1/2/NF-kB/MMP9信號通路進行了檢測,并使用MMP-9抑制劑TIMP-1加以驗證。其次借助R

10、T-PCR、ELISA、Western blot及免疫組化染色在裸鼠肝癌組織中再次進行上述檢測。最后采用細胞流式技術對體外CD133+的肝癌細胞進行定量分析研究,采用免疫組化染色對裸鼠肝癌組織中CD133指標進行檢測。
  上述實驗結果顯示,在體內及體外中,NC聯合索拉非尼均可使ERK1/2的磷酸化程度明顯降低,NF-kB/p65 DNA結合減少,最終導致MMP-9的表達下調,提示兩藥聯合可能通過該信號通路協同對腫瘤細胞的增殖、侵

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