單核細胞在外周血干細胞移植治療終末期肝病中的作用及其機制探討.pdf

1、粒細胞集落刺激因子（Granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF）動員的外周血干細胞（Peripheralbloodstemcells,PBSCs）移植，可導致血循環(huán)中中性粒細胞及血小板迅速增加，已成為造血干細胞移植的重要方法。然而，新近研究發(fā)現(xiàn)，PBSCs可向多種組織細胞分化，其在終末期肝病等多種損傷組織的修復過程中發(fā)揮了重要作用。動物實驗表明，G-CSF可促進骨髓干細胞向損傷肝臟遷移，誘發(fā)內(nèi)源性

2、肝細胞再生。臨床研究也證實，G-CSF動員或PBSCs移植均可有效改善終末期肝病患者的肝功能。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，自體PBSCs經(jīng)肝動脈回輸可提高乙肝相關性終末期肝病患者的白蛋白（Albumin,ALB）水平和CTP（Child-Turcotte-Pugh）評分。然而，PBSCs中存在著多個亞群的干細胞，是哪一亞群的細胞在此過程中發(fā)揮了作用，尚不清楚。
　　傳統(tǒng)觀點認為，外周血中的單核細胞是吞噬細胞的前體細胞，可定向分化為巨噬細

3、胞和樹突狀細胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中的單核細胞具有多向分化的潛能，可誘導分化為肝細胞、骨、心肌、神經(jīng)細胞和內(nèi)皮細胞等多種組織細胞。本課題組前期研究也證實，PBSCs中的單核細胞具有干細胞的潛能，可誘導分化為肝細胞樣的細胞。另外，多項研究顯示，循環(huán)中的單核細胞可能是肝硬化逆轉(zhuǎn)的重要調(diào)節(jié)細胞。單核細胞功能敲除的小鼠，可延緩四氯化碳（Carbontetrachloride，CCl4）誘導的肝纖維化降解的進程。同時，在損傷的肝臟，巨噬細胞可分

4、泌腫瘤壞死因子相關調(diào)亡誘導配體（TNF-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL），進而激活活化星形細胞（Hepaticstellatecells，HSCs）上的死亡受體，誘導其調(diào)亡。
　　然而，單核細胞是否為PBSCs移植治療終末期肝病真正的效應細胞，在終末期肝病的干細胞治療中發(fā)揮了重要的作用，尚不清楚。
　　【實驗目的】
　　1.檢測PBSCs中CD14+單核細胞亞群的干細胞潛能；

5、2.比較PBSCs中CD14+單核細胞和CD14-細胞移植對CCl4誘導的大鼠肝硬化的治療作用；3.探討CD14+單核細胞參與損傷肝臟修復可能的機制。
　　【材料和方法】
　　1.利用G-CSF動員雄性大鼠的外周血干細胞，以Ficoll為介質(zhì)通過密度梯度離心法分離PBSCs；2.通過免疫磁珠分選PBSCs中CD14+單核細胞亞群；3.利用形態(tài)學、流式細胞儀和細胞化學等檢測，觀察CD14+單核細胞亞群的干細胞潛能；4.將CCl

6、4誘導的雌性肝硬化大鼠隨機分為兩組，每組30只，分別從門靜脈輸注CM-DiI染料標記的CD14+單核細胞或CD14-細胞（1x107cells/rat）；5.通過生存分析、血清學和門靜脈壓力等檢測，對比CD14+單核細胞和CD14-細胞移植對大鼠肝硬化的治療效果；6.通過苦味酸天狼星紅染色、Masson三色染色、免疫組化和Real-timePCR等方法，檢測細胞移植對大鼠肝纖維化程度的影響；7.通過熒光示蹤和Y染色體原位末端標記（Pri

7、medinsitulabeling，PRINS）技術，觀察移植的CD14+單核細胞在損傷肝臟的定植情況；8.通過激光共聚焦檢測，觀察損傷肝臟中定植細胞的性質(zhì)；9.通過免疫組化和Real-timePCR等方法，觀察單核細胞移植對肝細胞再生能力的影響；10.通過原位凝膠酶譜、凝膠酶譜、Westernblot、Real-timePCR和激光共聚焦等方法，探討單核細胞逆轉(zhuǎn)肝纖維化可能的機制。
　　【結果】
　　1.大鼠PBSCs中C

8、D14+單核細胞亞群的分離及干細胞潛能的鑒定
　　流式細胞儀結果顯示，我們分離的PBSCs中的單核細胞，單核細胞標志物CD14和CD11b的表達率分別為95.4％±0.3％和93.7％±1.8％。該亞群的部分細胞可表達造血干細胞標志物CD34（1.1％±0.3％）、CD45（42.8％±4.6％），間充質(zhì)干細胞標志物CD44（50.1％±4.3％）以及多能干細胞的轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4（4.2％±1.1％）和Sox2（5.7％±1.

9、5％）。然而，內(nèi)皮細胞標志物CD133的表達則為陰性。另外，在塑料培養(yǎng)板上，該亞群細胞具有與單核細胞相似的良好的貼壁能力；在無外援性生長因子的作用下，RPMI1640培養(yǎng)3-5天后，其呈現(xiàn)出干細胞特有的集落生長能力。以上結果說明，PBSCs中CD14+單核細胞亞群具有干細胞潛能。
　　2.PBSCs中CD14+單核細胞和CD14-細胞對大鼠肝硬化治療效果的比較
　　將CCl4誘導的雌性肝硬化大鼠隨機分為兩組，每組30只，分別

10、從門靜脈輸注CD14+單核細胞或CD14-細胞。移植后4周，CD14+單核細胞移植組和CD14-細胞移植組大鼠血清中的ALT和AST水平較移植前均明顯減低。然而，相比CD14-細胞移植，CD14+單核細胞移植可有效提高大鼠血清中ALB水平和生存率，降低門靜脈壓力（p<0.01）。另外，通過天狼星紅染色、Masson三色染色和肝纖維化相關分子（FN、α-SMA和TGF-β）的檢測，我們發(fā)現(xiàn)CD14+單核細胞移植組大鼠的肝纖維化程度（2.1

11、％±0.9％）較CD14-細胞移植組（11.2％±2.3％）明顯減低（p<0.01）。Real-timePCR結果證實，移植后1周，CD14+單核細胞移植組大鼠肝組織中肝纖維化相關分子（FN,α2-(1)-procollagen,α-SMA和TGF-β）的mRNA表達較CD14-細胞移植組也明顯降低（p<0.01）。
　　3.單核細胞促進損傷肝臟肝細胞再生的機制
　　利用熒光示蹤技術，我們發(fā)現(xiàn)CM-DiI染料標記的單核細胞在

12、損傷肝臟中有定植，其主要分布于肝小葉的匯管區(qū)（86.9％±10.1％），少部分細胞位于肝實質(zhì)區(qū)內(nèi)（8.4％±2.5％）。PRINS結果也證實，移植的帶有Y染色體的單核細胞在雌性肝硬化模型鼠中確有定植。激光共聚焦結果顯示，這些定植的細胞中，僅有1.8％±0.4％的細胞具有肝細胞標志物ALB和CK18的表達；另外，肝巨噬/Kuffer細胞標志物F4/80的表達率為62.1％±9.8％，但肝干細胞標志物OV6和纖維母細胞標志物α-SMA的表達

13、為陰性。
　　免疫組化結果顯示，CD14+單核細胞移植組大鼠肝組織中肝細胞再生指數(shù)Ki-67的表達（移植后1周10.79％±2.98％，2周15.31％±3.24％）較CD14-細胞移植組（移植后1周6.16％±1.24％，2周8.45％±0.98％）明顯增加（p<0.01）。Real-timePCR結果證實，移植后1周，CD14+單核細胞移植組大鼠肝組織中肝細胞再生相關因子（HGF,TGF-α,EGF和VEGF）的mRNA表達，

14、較CD14-細胞移植組也明顯增高（p<0.01）。
　　4.單核細胞促進肝硬化逆轉(zhuǎn)的機制
　　通過原位凝膠酶譜和凝膠酶譜檢測，我們發(fā)現(xiàn)：CD14+單核細胞移植組大鼠肝組織中MMP-2和-9的活性較CD14-細胞移植組明顯增強；同時單核細胞移植后2周，肝組織中MMP-2和-9的分泌活性最高。Westernblot結果顯示，在CD14+單核細胞移植組大鼠肝組織中，不僅有MMP-2和-9蛋白表達的增加，而且MMP-13的表達也是增

15、高的。Real-timePCR結果證實，移植后1周，相比CD14-細胞移植組，CD14+單核細胞移植組大鼠肝組織中MMP-2，-9和-13的mRNA表達增高；另外TIMP-1的mRNA表達降低（p<0.01）。激光共聚焦結果顯示，部分定植的細胞可表達MMP-9和-13，但大部分MMP-9和-13的合成來源于內(nèi)源性肝組織細胞。
　　【結論】
　　本研究證實了PBSCs中CD14+單核細胞具有干細胞潛能，該亞群細胞的移植較CD1