四逆散含藥血清對(duì)抗大鼠肝干細(xì)胞氧化損傷并誘導(dǎo)其分化的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:分析四逆散及含藥血清中藥物成分，確定其體內(nèi)外物質(zhì)基礎(chǔ)，研究四逆散含藥血清對(duì)肝干細(xì)胞的增殖、抗氧化損傷、誘導(dǎo)分化作用及機(jī)制，探索四逆散在肝病治療中的可能機(jī)理，為四逆散更好地臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:采用HPLC-MS-MS法，梯度洗脫，測(cè)定四逆散及血清中有效成分，色譜條件:Betasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動(dòng)相A∶水，B∶乙腈，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，質(zhì)譜采用ESI源全

2、離子掃描方式，負(fù)離子檢測(cè)，在m/z100-1200范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜數(shù)據(jù)及相關(guān)信息確定四逆散水提物體外成分與血中物質(zhì)基礎(chǔ);用含藥血清作用WB-F344細(xì)胞24、48、72 h后，CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活性;用100μmol/L H2O2處理40 min后，加四逆散含藥血清作用24 h，CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活性，DCFH-DA染色、丙二醛(Methane Dicarboxylic Aldehyde，MDA)試劑盒檢測(cè)

3、細(xì)胞ROS含量及MDA含量，Hoechst33342染色觀(guān)察細(xì)胞核的變化，Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，并分析蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平，觀(guān)察含藥血清抗氧化損傷情況;Western blot法檢測(cè)甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)、角蛋白-19(Cytokeratin-19，CK-19)、細(xì)胞色素P4501A1、2B1、3A(CYP1A1，CYP2

4、B1，CYP3A)的表達(dá)，免疫熒光法定位觀(guān)察AFP、ALB在細(xì)胞中的變化，RT-PCR檢測(cè)AFP、ALB的mRNA水平，Elisa試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中AFP、ALB的水平，Mito Tracker Red染色法檢測(cè)線(xiàn)粒體數(shù)目，JC-1染色檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位，Clark氧電極檢測(cè)細(xì)胞耗氧量，DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)生成，PAS法檢測(cè)糖原合成功能，尿素氮檢測(cè)試劑盒觀(guān)察尿素氮合

5、成功能，研究四逆散含藥血清對(duì)肝干細(xì)胞分化作用及細(xì)胞功能的影響;Western blot觀(guān)察表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor，F(xiàn)GFR)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅰ型（Transforming Growth Factor beta Receptor typeⅠ，TGF-βRⅠ）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子

6、受體(Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR)、蛋白表達(dá)情況，觀(guān)察四逆散含藥血清誘導(dǎo)肝干細(xì)胞分化機(jī)制是否與EGFR、HGFR等細(xì)胞因子受體有關(guān);血糖試紙檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖的消耗量，乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)LDH、PK活性，乳酸、丙酮酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)乳酸、丙酮酸含量，熒光素酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量，分析

7、含藥血清對(duì)糖代謝的影響。
　　結(jié)果:在四逆散水提物中，檢測(cè)到甘草苷、橙皮苷、柚皮苷、柴胡皂苷a等成分，在四逆散血清中，檢測(cè)到芍藥苷、橙皮苷等成分以原型入血，還檢測(cè)到橙皮素葡萄糖醛酸等部分代謝物。含藥血清對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用;10％含藥血清具有抗H2O2引起的細(xì)胞損傷作用，降低受損細(xì)胞中ROS的含量，降低細(xì)胞MDA水平，降低細(xì)胞凋亡率;同時(shí)，10％含藥血清顯示出較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化的效果，肝干細(xì)胞分化標(biāo)志物AFP的蛋白及基因水平有降

8、低趨勢(shì)，ALB的蛋白及基因水平有升高趨勢(shì)，CK-19蛋白水平無(wú)明顯改變;線(xiàn)粒體數(shù)目、膜電位、耗氧率、ROS都有一定程度增加;糖原合成功能、尿素氮合成功能提高，CYP3A蛋白水平有一定增加，CYP1A2，2B1蛋白水平無(wú)明顯改變;含藥血清作用細(xì)胞后，EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白表達(dá)水平上升，細(xì)胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、LDH活性降低，PK活性、丙酮酸含量、ATP含量上升。
　　結(jié)論:四逆散含藥血清能夠促進(jìn)肝干細(xì)