肝損傷大鼠血清對臍帶間充質(zhì)干細胞的影響.pdf

1、目的:
　　尋找分離、擴增、鑒定臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)的方法，探討肝損傷大鼠血清對hUCMSCs的肝向誘導分化作用，為臨床上利用hUCMSCs治療終末期肝病患者提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用酶消化法分離培養(yǎng)hUCMSCs，在顯微鏡下觀察提取的臍帶源間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學改變。
　　2.流式細胞儀檢測間充質(zhì)干細胞標記CD73、CD105及造血干細胞標記CD34、CD45的表達。
　　3.使

2、用成脂誘導劑誘導分化23天后用油紅O染色，成骨誘導劑誘導分化21天后用茜素紅染色。
　　4.建立急性肝損傷大鼠模型:模型組腹腔注射四氯化碳-大豆油溶液，對照組腹腔注射等劑量的大豆油，48小時后腹主動脈取血，檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，取大鼠肝組織進行HE染色，顯微鏡下觀察這兩組大鼠肝臟病理學變化。
　　5.分別將肝損傷大鼠血清和胎牛血清用于培養(yǎng)hUCMSCs，分為實驗組和對照組。實驗組:20％模型

3、組大鼠血清配成的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs，對照組:20％胎牛血清配成的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs。觀察誘導前、實驗組及對照組培養(yǎng)后hUCMSCs細胞形態(tài)學改變，檢測培養(yǎng)液上清AFP、ALB值變化。
　　結(jié)果:
　　1.倒置顯微鏡下可見原代hUCMSCs貼壁生長，呈短梭形，6-7天后生長速度加快，細胞呈梭形，表現(xiàn)為編織狀或旋渦狀生長。
　　2.經(jīng)流式鑒定發(fā)現(xiàn)hUCMSCs表達CD73、CD105等間充質(zhì)干細胞標記，不表達C

4、D34、CD45等造血細胞標記。
　　3.P3代hUCMSCs成脂定向誘導23天后，未加成脂誘導劑的對照組細胞油紅O染色陰性，加入成脂誘導劑的實驗組細胞油紅O染色強陽性，大部分細胞中可見紅色的脂肪空泡。P3代hUCMSCs成骨定向誘導21天后，未加成骨誘導劑的對照組茜素紅染色陰性，加入成骨誘導劑的實驗組細胞茜素紅染色陽性，可見細胞間有黑色顆粒沉積，顆粒大小不等，形態(tài)不一，提示有黑色礦物質(zhì)沉積。
　　4.四氯化碳模型組大鼠血清

5、與對照組相比，ALT、AST升高明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組大鼠肝組織光鏡下可見肝竇結(jié)構(gòu)消失，肝細胞脂肪變性、灶狀壞死，細胞核固縮、碎裂或溶解，肝細胞間及匯管區(qū)可見少量炎性細胞浸潤。對照組光鏡下見肝組織結(jié)構(gòu)清晰，無細胞水腫、變性及壞死，無炎性細胞浸潤。
　　5.肝損傷大鼠血清培養(yǎng)hUCMSCs第1天細胞形態(tài)變化不大，呈梭形，仍呈編織狀或旋渦狀生長。第2天細胞呈短梭形，第3天細胞呈類圓形，第4天呈圓形，并有極少量

6、細胞漂浮。對照組細胞呈長纖維狀。肝損傷大鼠血清培養(yǎng)hUCMSCs四天后檢測上清液ALB發(fā)現(xiàn)實驗組ALB較誘導前和對照組均有升高趨勢(P＜0.001)，AFP無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.可從臍帶組織中成功提取間充質(zhì)干細胞。
　　2.提取的干細胞能貼壁生長，可表達間充質(zhì)干細胞標記CD73、CD105，不表達造血干細胞標記CD34、CD45，具有向脂肪細胞、骨細胞分化的潛能。
　　3.10％四氯化碳-大豆油溶液腹