RIP、c-FLIP基因在肝癌中的表達意義及其在TRAIL誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡中的作用.pdf

1、第一章RIP，c-FLIP在肝癌中的表達及意義
　　目的:
　　受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)是在腫瘤壞死因子(TNF)信號途徑中發(fā)揮重要作用的效應(yīng)器，在細胞增殖和凋亡過程中起重要作用。細胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(celluar FLICE-like inhibitory protein，c-FLIP)是一種重要的細胞凋亡抑制蛋白。本章旨在探究

2、RIP，c-FLIP在肝癌中的表達及意義。
　　方法:
　　選取2005年1月至2009年12月期間在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院普外科和湘雅醫(yī)院普外科確診的80例肝癌患者的肝癌組織進行研究，再取肝內(nèi)膽管結(jié)石患者正常肝組織40例作為對照。應(yīng)用免疫組化法對實驗組及對照組中c-FLIP和RIP蛋白的表達情況進行檢測。分析RIP和c-FLIP在肝癌組織中的表達與腫瘤的病理學(xué)分級和患者臨床分期及復(fù)發(fā)遠處轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:

3、r>　　RIP、c-FLIP的表達定位于細胞胞漿中，肝癌實驗組陽性細胞表達率分別為78.8％和85.0％，而在對照組正常肝組織中陽性細胞表達率分別為12.5％和17.5％。RIP和c-FLIP陽性表達與肝癌遠處轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，而與腫瘤大小、臨床分期等其他因素?zé)o關(guān)。RIP和c-FLIP在肝癌組織中表達呈顯著正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.c-FLIP、RIP在肝癌組織中高表達而在肝正常組織中低表達。
　　2.c-FLI

4、P和RIP在肝癌組織中的表達水平與肝癌患者的臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。
　　3.c-FLIP和RIP可能共同參與了肝癌的細胞凋亡、發(fā)生、發(fā)展。
　　第二章RIP、c-FLIP基因表達在TRAIL誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡中的作用
　　目的:
　　腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)通過死亡受體途徑誘導(dǎo)的細胞凋亡是

5、體內(nèi)天然抗腫瘤的重要機制，但是TRAIL抵抗是肝癌預(yù)后不良的重要原因?；熕幬锬苣孓D(zhuǎn)肝癌細胞HepG2及Hep3B對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的抵抗，其機理在于下調(diào)傳導(dǎo)TRAIL信號的死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death-inducing signaling complex，DISC)中RIP和c-FLIP的表達。本章構(gòu)建RIP和c-FLIP基因沉默的肝癌細胞模型，旨在研究RIP和c-FLIP的表達變化對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的影響。
　　方法:<

6、br>　　通過siRNA(small interfering RNA)技術(shù)建立HepG2及Hep3B細胞系的RIP和/或c-FLIP基因沉默的亞克隆細胞模型，并進行下列研究:進行TRAIL誘導(dǎo)凋亡的DISC分析，明確細胞凋亡信號的傳導(dǎo)是否受阻于DISC水平;應(yīng)用c-FLIP、RIP的siRNA，進一步檢測c-FLIP、RIP在抑制半胱-天冬氨酸蛋白酶8(cysteine containingaspirate specific prote

7、ase8,Caspase-8)活性。
　　結(jié)果:
　　用TRAIL治療濃度100 ng/ml按不同時間處理HepG2及Hep3B細胞系，Caspase-8/9/3的活化程度減弱，并且沒有DFF45的裂解?；熕幬锝z裂霉素、阿霉素作用后，對DISC內(nèi)DR4、DR5的表達無明顯影響，TRAIL單獨應(yīng)用組c-FLIP及RIP的表達明顯較強，F(xiàn)ADD的表達水平較低，經(jīng)化療藥物作用后，明顯下調(diào)了c-FLIP及RIP的表達及上調(diào)了FAD

8、D的表達。干擾c-FLIP和RIP的基因表達后，隨著TRAIL作用濃度的增加，其殺傷細胞的能力也逐漸增加，并且，這種殺傷細胞的效應(yīng)是通過誘發(fā)細胞凋亡來實現(xiàn)的，細胞周期分析顯示，與對照組相比，siRNA組的subG1百分率明顯增高，細胞明顯出現(xiàn)G1期生長阻滯。
　　結(jié)論:
　　1.Caspase-8的活化受抑是肝癌細胞系HepG2及Hep3B對TRAIL抵抗的直接原因。
　　2.c-FLIP及RIP在DISC內(nèi)的高表達是

9、肝癌細胞系HepG2及Hep3B對TRAIL抵抗的主要原因。
　　3.c-FLIP及RIP的表達下調(diào)能夠解除Caspase-8的受抑狀態(tài)，促進凋亡信號的傳導(dǎo)。
　　第三章調(diào)節(jié)RIP、c-FLIP對TRAIL誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的影響
　　目的:
　　癌癥細胞的生存依賴于糖代謝以及此代謝過程中產(chǎn)生的ATP供能，抑制糖代謝的過程是抗癌癥治療的一種可能方案。2-脫氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG

10、)是一種合成的糖原類似物，是由已糖激酶磷酸化后轉(zhuǎn)移至細胞，但它不能被完全代謝。2-DG的磷酸化在細胞中積聚，使得正常糖代謝的磷酸化過程受到干擾和抑制，并導(dǎo)致ATP被大量消耗。2-DG也能夠?qū)е碌鞍椎奶腔艿揭种疲瑢?dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)張力增高，并增加激活蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)。研究表明，2-DG具有調(diào)節(jié)RIP、c-FLIP的作用。本章旨在從2-DG角度，探究2-DG與RIP、c-FLIP的關(guān)系，進而闡

11、明調(diào)節(jié)RIP、c-FLIP對TRAIL誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的影響。
　　方法:
　　通過細胞生存能力分析、線粒體膜電位變化和PI染色測定細胞凋亡來研究2-DG對肝癌細胞凋亡的影響及其機制。通過定量RT-PCR、Western blot分析和siRNA技術(shù)研究2-DG對RIP、c-FLIP的調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)RIP、c-FLIP對肝癌細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　2-DG單獨時并不誘導(dǎo)明顯細胞凋亡，但是，它可以抑制細胞的分

12、化;2-DG和TRAIL結(jié)合增強了TRAIL誘導(dǎo)的抗分化和細胞凋亡。本研究用JC-1熒光探針標記線粒體膜的變化，出現(xiàn)損壞的線粒體膜時，JC-1的染色顯示綠色熒光，正常細胞顯示紅色熒光，肝癌細胞與2-DG和TRAIL結(jié)合后出現(xiàn)明顯線粒體膜的損害，顯示綠色熒光。caspase抑制劑z-VAD-fmk能抑制HepG2細胞系和Hep3B細胞系出現(xiàn)TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡。更為重要是在有2-DG和缺乏2-DG的情況下，在caspase抑制劑作用下

13、TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡情況有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。用定量RT-PCR研究顯示在2-DG作用3小時后，RIP、c-FLIP的表達量持續(xù)降低。siRNA時，RIP、C-FLIP的下調(diào)與2-DG有密切的相關(guān)性，通過2-DG下調(diào)RIP、c-FLIP的表達是增加TRAIL誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡敏感性的關(guān)鍵。
　　結(jié)論:
　　1.RIP、c-FLIP可通過2-DG被下調(diào)，進而增加TRAIL誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡。
　　2.2