Vam3對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞自噬的影響及作用機(jī)理研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾?。–hronicObstructivePulmonaryDisease，COPD）是危及全球人類健康的重大疾病。目前，慢性阻塞性肺疾病是第四位最常見(jiàn)的死亡原因，僅次于心臟疾病，也是第二位造成勞動(dòng)力喪失的重要原因?；诼宰枞苑渭膊?yán)重影響人類健康，且發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此在其預(yù)防、診斷和治療上還存在很大的缺口，現(xiàn)有的臨床治療藥物中也存在長(zhǎng)期的副作用或難吸收等各種各樣的問(wèn)題。隨著近幾年對(duì)氧化應(yīng)激機(jī)制研究的深入，一些抗氧化

2、劑也相繼問(wèn)世，并表現(xiàn)出能夠改善慢性阻塞性肺疾病患者的癥狀，延緩疾病進(jìn)展等方面的作用。因此研發(fā)出高效。低毒易吸收的抗氧化劑具有較好的商業(yè)前景。本研究的目的就是針對(duì)慢性阻塞性肺疾病的氧化應(yīng)激機(jī)制環(huán)節(jié)，評(píng)價(jià)白藜蘆醇二聚體衍生物-Vam3對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致肺部自噬形成的影響，以期開(kāi)發(fā)出優(yōu)于白藜蘆醇的抗氧化劑。
　　 本研究通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)首次證明了Vam3可通過(guò)抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的自噬過(guò)度激活而發(fā)揮防治慢性阻塞性肺疾病的作用。首

3、先，用不同濃度的煙霧凝集物處理人支氣管上皮細(xì)胞不同時(shí)間，通過(guò)WesternBlot與免疫熒光方法檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)自制的煙霧凝集物能夠誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞過(guò)度自噬，且300mg/L煙霧凝集物處理細(xì)胞12小時(shí)誘導(dǎo)的自噬最為明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以此濃度和時(shí)間為處理?xiàng)l件。其次，我們采用自噬抑制劑巴佛洛霉素處理細(xì)胞，并與煙霧凝集物聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)，進(jìn)一步顯示了煙霧凝集物能夠顯

4、著誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生自噬。
　　 我們以白藜蘆醇為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過(guò)WesternBlot和免疫熒光法觀察到Vam3能夠抑制煙霧凝集物誘導(dǎo)的自噬，1μmol/L濃度尤為顯著，且抑制作用優(yōu)于白藜蘆醇。為了探討Vam3抑制自噬的分子作用機(jī)制，我們用IP，WesternBlot方法檢測(cè)了Sirt1和FoxO3a的表達(dá)及活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示煙霧凝集物處理細(xì)胞后，Sirt1的表達(dá)及活性水平均下調(diào)，而Vam3能夠上調(diào)或維持Sirt1的表達(dá)

5、及活性。另外，煙霧凝集物能夠下調(diào)總FoxO3a和磷酸化FoxO3a的表達(dá)，促進(jìn)FoxO3a入核，并上調(diào)其乙?；剑鳹am3則能逆轉(zhuǎn)FoxO3a的上述改變，且作用效果好于白藜蘆醇。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Vam3是否是通過(guò)Sirt1發(fā)揮作用的，我們敲降人支氣管上皮細(xì)胞中Sirt1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Vam3幾乎不能夠逆轉(zhuǎn)自噬的過(guò)度激活。此外，我們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS及GSH-Px的含量發(fā)現(xiàn)，Vam3能夠抑制煙霧凝集物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們建立

6、了熏煙小鼠模型，病理切片HE染色顯示Vam3能夠改善熏煙小鼠肺部的病理變化。肺組織均漿的WesternBlot檢測(cè)及肺組織石蠟切片的免疫組化檢測(cè)均顯示Vam3能夠抑制熏煙小鼠肺部的自噬，并逆轉(zhuǎn)香煙煙霧誘導(dǎo)的Sirt1和FoxO3a表達(dá)下調(diào)。
　　 綜上所述，本文首次發(fā)現(xiàn)了Vam3具有抗氧化、抗自噬的作用，且作用效果優(yōu)于白藜蘆醇；Vam3可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)節(jié)Sirt1/FoxO3a通路，抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的自噬激活，進(jìn)而發(fā)揮