丙肝NS4B蛋白誘導(dǎo)肝細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)改變的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討丙肝非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B在上皮細(xì)胞間質(zhì)改變中所起的作用，以及其分子機(jī)制。
　　方法：1.用高保真Taq酶從含有全長1b型HCV質(zhì)粒中擴(kuò)增出NS4B片段，運(yùn)用EcoRI和BamHI雙酶切法構(gòu)建重組的PEGFPC1-NS4B質(zhì)粒，qRT-PCR、Westernblot、細(xì)胞免疫熒光方法檢測質(zhì)粒是否可在真核細(xì)胞表達(dá)丙肝NS4B蛋白；2.用陽離子脂質(zhì)體將空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，或在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染

2、空質(zhì)粒，1μg，3μg，5μg重組質(zhì)粒，48h后，qRT-PCR、Western blot來檢測E-cadhrin、N-cadherin基因和蛋白表達(dá)變化，以觀察HepG2細(xì)胞是否發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)改變；3.與2中相同的方法檢測HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Snail基因和蛋白變化，并且通過shRNA沉默snail的表達(dá)以觀察snail在丙肝NS4B導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間質(zhì)改變中所起的作用；4.用細(xì)胞劃痕實驗觀察轉(zhuǎn)染了丙肝NS4B重組質(zhì)粒及共轉(zhuǎn)染重組

3、質(zhì)粒和Snail shRNA的HepG2細(xì)胞遷徙能力的改變；5.Westernblot檢測Scribble-Hippo-PI3K/AKT信號通路變化，以探究丙肝NS4B蛋白引起上皮細(xì)胞間質(zhì)改變分子機(jī)制。
　　結(jié)果：1.測序及雙酶切鑒定結(jié)果顯示讀碼框和插入方向完全正確，并且在兩端成功插入了起始密碼子和終止密碼子，雙酶切片段結(jié)果為4725bp和796bp長度兩個片段，鑒定結(jié)果顯示目的基因已經(jīng)插入PEGFPC1空質(zhì)粒中，重組PEGFPC

4、1-NS4B質(zhì)?？稍贖epG2細(xì)胞中瞬時表達(dá)。
　　2.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞相較于對照組而言，qRT-PCR顯示E-cadhrin mRNA表達(dá)下調(diào)、N-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào)。Western blot結(jié)果顯示E-cadhrin蛋白水平表達(dá)下調(diào)、N-cadherin蛋白水平表達(dá)上調(diào)。同時E-cadhrin的蛋白表達(dá)隨著丙肝NS4B表達(dá)的增加而減少，N-cadherin蛋白的表達(dá)隨著丙肝NS4B表達(dá)的增

5、加而增加，說明NS4B蛋白表達(dá)是引起上皮細(xì)胞間質(zhì)改變的根本原因。
　　3.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞相較于對照組而言， Westernblot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)上調(diào)，且Snail隨著丙肝NS4B蛋白表達(dá)增加而增加，但qRT-PCR結(jié)果顯示表達(dá)丙肝NS4B組和對照組其snail mRNA表達(dá)水平相差不大，說明Snail蛋白變化發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平；沉默snail表達(dá)可扭轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)改變。
　

6、　4.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞遷徙能力較未轉(zhuǎn)染組增強(qiáng)，而共轉(zhuǎn)染NS4B質(zhì)粒和Snail shRNA的HepG2細(xì)胞遷徙能力并未明顯增加。
　　5.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞與對照組相比，可與Scribble蛋白相互作用并導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，Scribble下游Hippo信號通路中p-yap蛋白表達(dá)下調(diào)，但total-yap表達(dá)無明顯變化，p-yap/total-yap減少，Hippo信號通路被抑制，而p-ak