神經(jīng)免疫性疾病血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、自身免疫性疾病是一大類(lèi)由于自身免疫系統(tǒng)的免疫耐受或者免疫監(jiān)視功能異常,引起針對(duì)自身抗原的破壞性的免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的疾病。自身免疫性疾病發(fā)病部位廣泛,常見(jiàn)的有結(jié)締組織自身免疫性疾病(類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎),消化系統(tǒng)自身免疫性疾病(肝炎),泌尿系統(tǒng)自身免疫性疾病(腎炎)等等。
　　 發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病,稱為神經(jīng)免疫性疾病。神經(jīng)免疫性疾病的研究較少,主要集中在以多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)為代表的中樞神

2、經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病(病灶以累及大腦、小腦、腦干為主。)；格林-巴利綜合癥為代表的周?chē)窠?jīng)脫髓鞘疾病；重癥肌無(wú)力為代表的胸腺自身免疫性疾病。神經(jīng)免疫性疾病嚴(yán)重危害人體健康,至今仍沒(méi)有特異性的生物標(biāo)記物對(duì)其診斷、治療。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織/體液基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì),是在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于:能同時(shí)對(duì)成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)進(jìn)行分析、檢測(cè),克

3、服了傳統(tǒng)研究手段的局限,從系統(tǒng)生物學(xué)角度研究蛋白質(zhì)間的變化及作用,更有利于發(fā)現(xiàn)新的對(duì)疾病發(fā)生有潛在意義的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。
　　 血清(serum):是指血液凝固后,在血漿中,除去纖維蛋白原所分離出的淡黃色透明液體。血清作為一種復(fù)雜的體液成份,含有小分子,鹽,蛋白質(zhì)等多種物質(zhì),而血清蛋白組分的改變能夠精確地反映機(jī)體的病理變化過(guò)程,因此開(kāi)展血清蛋白組學(xué)研究,將有利于闡明疾病發(fā)生機(jī)理,可為疾病診斷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究

4、成功建立了神經(jīng)免疫性疾病血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系并結(jié)合Westernblot驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),比較了神經(jīng)免疫性疾病(如,多發(fā)性硬化)組血清與對(duì)照組(其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病)血清的蛋白質(zhì)組的變化,尋找與該疾病的發(fā)生機(jī)制相關(guān)的具有潛在意義的生物標(biāo)記物,以期從蛋白質(zhì)及系統(tǒng)生物學(xué)水平探討其發(fā)病的機(jī)理,為臨床診斷、預(yù)后及治療提供有力的理論依據(jù)。
　　 第一部分血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系的建立
　　 目的:對(duì)人血清蛋白質(zhì)樣品制備方法進(jìn)行比較優(yōu)化,以建立

5、完善的血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系。
　　 方法:收集血清,分別采用五種不同的沉淀法提取總蛋白。之后,進(jìn)行雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)組,染色以及ImageMaster2D圖像軟件統(tǒng)計(jì)、比較分析。
　　 結(jié)果:成功獲得不同的血清蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜,并對(duì)丙酮沉淀法,三氯醋酸沉淀法,三氯醋酸/丙酮沉淀法,蛋白純化試劑盒處理血清所得到的2DE圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為(1802±12),(1648±10),(1727±13)

6、,(1670±14)個(gè)；去除白蛋白及免疫球蛋白血清所得到的圖譜與丙酮沉淀血清所得到的圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì),得到平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為(1212±16),(1258±12)個(gè)。
　　 結(jié)論:不同血清沉淀方法對(duì)血清雙向電泳各有優(yōu)劣；血清去除白蛋白及免疫球蛋白之后,可以提高低豐度蛋白的檢出,但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致部分蛋白點(diǎn)的丟失。
　　 第二部分神經(jīng)免疫性疾病的血清蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用研究
　　 目的:在本人建立的血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系的基礎(chǔ)上

7、,對(duì)神經(jīng)免疫性疾病患者血清進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,同時(shí)應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),探索與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物以及生物標(biāo)記物與該疾病間的關(guān)系,為其發(fā)病機(jī)理的探索、臨床診斷和治療提供依據(jù)。
　　 方法:收集MS疾病組與對(duì)照組血清,冷丙酮沉淀提取蛋白,分別用Cy3和Cy5熒光染料按最小標(biāo)記法對(duì)MS樣本及對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)記。另再取等量混合蛋白用Cy2標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)?；旌蟽山M樣品后分別在2塊雙向熒光差異凝膠電泳(2-Dimensional

8、fluorescence Difference In-Gel Electrophoresis,2D-DIGE)膠上進(jìn)行電泳,通過(guò)Typhoon9400多功能熒光掃描儀掃描及DeCyder2D差異分析軟件進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組分析,篩選出表達(dá)有顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization Time-Of-Flight Mass Spectrosc

9、opy,MALDI/TOF MS)得到肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting,PMF),搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行鑒定,采用Western blot對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:分別獲得MS患者及對(duì)照組血清蛋白質(zhì)組雙向熒光差異凝膠電泳表達(dá)圖譜,21個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在兩組凝膠圖譜上存在明顯差異,4個(gè)點(diǎn)在MS組顯著上調(diào),17個(gè)點(diǎn)下調(diào)。以維生素D結(jié)合蛋白(Vitamin D binding prote