神經(jīng)免疫性疾病血清蛋白質(zhì)組學技術體系建立及其應用研究.pdf

1、自身免疫性疾病是一大類由于自身免疫系統(tǒng)的免疫耐受或者免疫監(jiān)視功能異常,引起針對自身抗原的破壞性的免疫反應所導致的疾病。自身免疫性疾病發(fā)病部位廣泛,常見的有結締組織自身免疫性疾病(類風濕性關節(jié)炎),消化系統(tǒng)自身免疫性疾病(肝炎),泌尿系統(tǒng)自身免疫性疾病(腎炎)等等。
　　 發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病,稱為神經(jīng)免疫性疾病。神經(jīng)免疫性疾病的研究較少,主要集中在以多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)為代表的中樞神

2、經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病(病灶以累及大腦、小腦、腦干為主。)；格林-巴利綜合癥為代表的周圍神經(jīng)脫髓鞘疾病；重癥肌無力為代表的胸腺自身免疫性疾病。神經(jīng)免疫性疾病嚴重危害人體健康,至今仍沒有特異性的生物標記物對其診斷、治療。
　　 蛋白質(zhì)組學(proteomics)是指一個細胞或一個組織/體液基因組所表達的全部蛋白質(zhì),是在整體水平上研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律。蛋白質(zhì)組學技術最大的優(yōu)勢在于:能同時對成千上萬種蛋白質(zhì)進行分析、檢測,克

3、服了傳統(tǒng)研究手段的局限,從系統(tǒng)生物學角度研究蛋白質(zhì)間的變化及作用,更有利于發(fā)現(xiàn)新的對疾病發(fā)生有潛在意義的蛋白質(zhì)靶點。
　　 血清(serum):是指血液凝固后,在血漿中,除去纖維蛋白原所分離出的淡黃色透明液體。血清作為一種復雜的體液成份,含有小分子,鹽,蛋白質(zhì)等多種物質(zhì),而血清蛋白組分的改變能夠精確地反映機體的病理變化過程,因此開展血清蛋白組學研究,將有利于闡明疾病發(fā)生機理,可為疾病診斷提供理論和實驗依據(jù)。
　　 本研究

4、成功建立了神經(jīng)免疫性疾病血清蛋白質(zhì)組學技術體系并結合Westernblot驗證實驗,比較了神經(jīng)免疫性疾病(如,多發(fā)性硬化)組血清與對照組(其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病)血清的蛋白質(zhì)組的變化,尋找與該疾病的發(fā)生機制相關的具有潛在意義的生物標記物,以期從蛋白質(zhì)及系統(tǒng)生物學水平探討其發(fā)病的機理,為臨床診斷、預后及治療提供有力的理論依據(jù)。
　　 第一部分血清蛋白質(zhì)組學技術體系的建立
　　 目的:對人血清蛋白質(zhì)樣品制備方法進行比較優(yōu)化,以建立

5、完善的血清蛋白質(zhì)組學技術體系。
　　 方法:收集血清,分別采用五種不同的沉淀法提取總蛋白。之后,進行雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)組,染色以及ImageMaster2D圖像軟件統(tǒng)計、比較分析。
　　 結果:成功獲得不同的血清蛋白質(zhì)組表達圖譜,并對丙酮沉淀法,三氯醋酸沉淀法,三氯醋酸/丙酮沉淀法,蛋白純化試劑盒處理血清所得到的2DE圖譜進行統(tǒng)計分析,得到平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為(1802±12),(1648±10),(1727±13)

6、,(1670±14)個；去除白蛋白及免疫球蛋白血清所得到的圖譜與丙酮沉淀血清所得到的圖譜進行統(tǒng)計,得到平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為(1212±16),(1258±12)個。
　　 結論:不同血清沉淀方法對血清雙向電泳各有優(yōu)劣；血清去除白蛋白及免疫球蛋白之后,可以提高低豐度蛋白的檢出,但同時會導致部分蛋白點的丟失。
　　 第二部分神經(jīng)免疫性疾病的血清蛋白質(zhì)組學應用研究
　　 目的:在本人建立的血清蛋白質(zhì)組學技術體系的基礎上

7、,對神經(jīng)免疫性疾病患者血清進行比較蛋白質(zhì)組學研究,同時應用定量蛋白質(zhì)組學技術,探索與發(fā)病機制相關的潛在生物標記物以及生物標記物與該疾病間的關系,為其發(fā)病機理的探索、臨床診斷和治療提供依據(jù)。
　　 方法:收集MS疾病組與對照組血清,冷丙酮沉淀提取蛋白,分別用Cy3和Cy5熒光染料按最小標記法對MS樣本及對照組進行標記。另再取等量混合蛋白用Cy2標記作為內(nèi)標?；旌蟽山M樣品后分別在2塊雙向熒光差異凝膠電泳(2-Dimensional

8、fluorescence Difference In-Gel Electrophoresis,2D-DIGE)膠上進行電泳,通過Typhoon9400多功能熒光掃描儀掃描及DeCyder2D差異分析軟件進行定量蛋白質(zhì)組分析,篩選出表達有顯著差異的蛋白質(zhì)點,應用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization Time-Of-Flight Mass Spectrosc

9、opy,MALDI/TOF MS)得到肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting,PMF),搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫對其進行鑒定,采用Western blot對鑒定結果進行驗證。
　　 結果:分別獲得MS患者及對照組血清蛋白質(zhì)組雙向熒光差異凝膠電泳表達圖譜,21個蛋白質(zhì)點在兩組凝膠圖譜上存在明顯差異,4個點在MS組顯著上調(diào),17個點下調(diào)。以維生素D結合蛋白(Vitamin D binding prote