NAC1-FOXQ1分子通路在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是第八大婦女最常見的惡性腫瘤，每年全世界新增診斷為卵巢癌的病例約有225，000例;卵巢癌也是致死率最高的婦科惡性腫瘤，死亡率約為140，000例/年。雖然，早期卵巢癌（Ⅰ期和Ⅱ期）預(yù)后較好，但大多數(shù)婦女就診時(shí)，已經(jīng)處于卵巢癌晚期（Ⅲ期和Ⅳ期），此時(shí)5年存活率只有40％左右。究其原因，現(xiàn)在對于卵巢癌的分子發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，針對卵巢癌現(xiàn)在還沒有一種敏感性及特異性好的早期篩查方法。而對于卵巢癌的治療，雖然手術(shù)聯(lián)合一線以鉑類和紫杉醇

2、為主的化療，使病人的初治反應(yīng)率可以達(dá)到80％左右，但幾乎所有病人最后都會復(fù)發(fā)?，F(xiàn)在也有許多針對卵巢癌的分子靶向治療方法，但迄今為止，臨床試驗(yàn)仍未發(fā)現(xiàn)療效優(yōu)于以鉑類藥物為主的聯(lián)合治療方案。
　　 在過去的幾年中，學(xué)術(shù)界對卵巢癌及其前體病變的認(rèn)識發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變，越來越多的證據(jù)表明，原來被認(rèn)為是一種單一體疾病的卵巢癌，實(shí)際上是由多個(gè)無論是在形態(tài)、病理生理、分子改變和臨床進(jìn)展方面均不同的個(gè)體腫瘤所組成的混合體。而卵巢癌中所占比例較高

3、的上皮性卵巢癌從大的方面又劃分為兩型，每一型又分為不同的亞型。Ⅰ型卵巢癌包括卵巢低級別漿液性癌、低級別內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌、粘液性癌及Brenner腫瘤。此型腫瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)往往處于疾病早期，進(jìn)展緩慢，經(jīng)常表現(xiàn)為一種從良性病變漸漸發(fā)展成交界性病變最后進(jìn)展為惡性病變的過程。此型腫瘤細(xì)胞基因組相對穩(wěn)定，常見的基因突變有KRAS、BRAF、ERBB2、CTNNB1、PTEN、 PIK3CA、ARID1A及PPP2R1A。Ⅱ型卵巢癌主要包括卵巢高級別

4、漿液性癌、高級別內(nèi)膜樣癌、未分化癌及混合性中胚層癌。臨床進(jìn)展迅速，惡性度高，侵襲性強(qiáng)，病人就診時(shí)往往已處于疾病晚期。分子表型特征性改變是常見的TP53基因突變及基因組染色質(zhì)不穩(wěn)定性。大量研究表明，卵巢高級別和低級別漿液性癌的前體病變極有可能均源于輸卵管上皮，而非卵巢表面上皮，尤其是發(fā)病率相對最高的卵巢高級別漿液性癌，其前體病變很可能是輸卵管傘端的漿液性輸卵管上皮內(nèi)癌變(STIC)。卵巢內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌，雖然它們各自導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的

5、分子通路不同，但其前體病變均被認(rèn)為與子宮內(nèi)膜異位癥病灶相關(guān)。
　　 之前大多數(shù)的研究將卵巢癌視為一種疾病，新的卵巢癌分型和起源學(xué)說為進(jìn)一步探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了良好的理論依據(jù)和指導(dǎo)方向。全面掌握介導(dǎo)不同類型卵巢癌進(jìn)展的相關(guān)分子通路知識，將會十分具有臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義。已發(fā)表的研究表明，NAC1分子可以通過多方面機(jī)制調(diào)控上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展及化療耐藥等表型，但至今對NAC1如何介導(dǎo)這些促腫瘤機(jī)制發(fā)生仍不清楚?；诖耍菊n

6、題首先利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)，發(fā)現(xiàn)NAC1可能的下游調(diào)控基因，最后選取FOXQ1作為進(jìn)一步的研究對象，通過下述兩個(gè)方面闡述NAC1/FOXQ1分子通路在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　 第一部分NAC1在上皮性卵巢癌中對FOXQ1的調(diào)控機(jī)制研究
　　 研究背景和目的:
　　 近年來，關(guān)于BTB/POZ家族成員基因介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的報(bào)道越來越多，BTB結(jié)構(gòu)域（也稱為POZ結(jié)構(gòu)域）是介導(dǎo)蛋白相互作用的重要結(jié)構(gòu)域，含有B

7、TB結(jié)構(gòu)域的蛋白通過形成二聚體或低聚體分子，來調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞生物學(xué)功能。本課題組前期利用基因表達(dá)連續(xù)分析(SAGE)技術(shù)，研究130個(gè)BTB家族成員基因發(fā)現(xiàn)，NACC1(nucleus accumbens-associated1)是一個(gè)新的潛在的腫瘤相關(guān)BTB/POZ家族基因。NACC1基因編碼細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NAC1的表達(dá)，其定位于人染色體區(qū)Ch19p13.2。分析人類腫瘤基因組圖譜TCGA(The Cancer Genome Atlas)

8、數(shù)據(jù)庫顯示，約18％卵巢高級別漿液性癌存在此區(qū)域的基因拷貝數(shù)擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也證實(shí)，NAC1 mRNA表達(dá)水平和基因拷貝數(shù)呈正相關(guān)(R＞0.54)。所以，NAC1過表達(dá)是卵巢漿液性癌發(fā)生的一個(gè)重要的分子基因改變表型?，F(xiàn)在眾多研究還發(fā)現(xiàn)，NAC1在多種腫瘤細(xì)胞中存在過表達(dá)狀態(tài)，如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等。
　　 利用免疫組化技術(shù)研究NAC1在卵巢組織中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，卵巢正常上皮細(xì)胞無NAC1著色，而在卵巢癌

9、細(xì)胞中，隨著病理級別的升高，NAC1表達(dá)逐漸增強(qiáng)。NAC1在卵巢漿液性癌中的表達(dá)約為50％，顯著高于其他卵巢癌組織類型。相對于NAC1低表達(dá)的卵巢癌病例，NAC1過表達(dá)病人的總生存率和無疾病生存率均顯著下降。分子細(xì)胞學(xué)水平研究表明，NAC1具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生，維持腫瘤細(xì)胞生長，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。它還影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，參與HMGB1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬反應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老等。NAC1不但調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程而且還影響腫瘤

10、對化療的反應(yīng)，可以介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞出現(xiàn)化療耐藥表型，是影響卵巢癌生物學(xué)行為的一個(gè)重要的相關(guān)分子。
　　 然而對于NAC1如何發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的功能，如何通過調(diào)控下游基因介導(dǎo)上述腫瘤生物學(xué)表型發(fā)生的機(jī)制，至今還不是很清楚。本課題利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，研究卵巢癌細(xì)胞中NAC1調(diào)控的基因，并探討其在腫瘤細(xì)胞中所介導(dǎo)的NAC1生物學(xué)作用，以期對NAC1信號通路有一個(gè)更好的把握，為將來進(jìn)行基于NAC1分子的靶向治療研究提供新的理論依據(jù)。

11、r>　　 研究方法和結(jié)果:
　　 通過比較NAC1高表達(dá)或沉默的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞不同基因表達(dá)譜，我們發(fā)現(xiàn)NAC1降表達(dá)后，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而影響細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移的信號通路，NOTCH信號通路及上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)信號通路的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。NAC1的下游調(diào)控基因有FOXQ1，F(xiàn)OXA2，JAGGED1，NOTCH1，IGFBP6，DBNL，DVL1，SNF2H及KBTBD8等。這些基因中，最后

12、選取與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力相關(guān)的FOXQ1分子來進(jìn)行進(jìn)一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NACC1基因沉默后， FOXQ1的表達(dá)及啟動子活性明顯降低。誘導(dǎo)NAC1的BTB結(jié)構(gòu)域從而抑制NAC1二聚體形成而降低NAC1分子活性，F(xiàn)OXQ1表達(dá)也會降低。而在不表達(dá)NAC1的轉(zhuǎn)基因小鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞中，異位表達(dá)NAC1會相應(yīng)地增加FOXQ1分子的表達(dá)。從而在不同的角度，驗(yàn)證了NAC1分子對FOXQ1分子的調(diào)控作用。表型研究發(fā)現(xiàn)，利用基因沉默的方法降低NAC1

13、表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力明顯降低，而異位表達(dá)FOXQ1可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)這一細(xì)胞學(xué)表型，顯著增加細(xì)胞的移動能力，這說明FOXQ1參與了NAC1分子對卵巢癌細(xì)胞移行能力的調(diào)控。在高級別漿液性卵巢癌中，通過生物信息學(xué)挖掘，我們還發(fā)現(xiàn)NACC1基因和FOXQ1基因存在顯著的表達(dá)共上調(diào)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了NAC1/FOXQ1分子通路在上皮性卵巢癌中的重要作用。
　　 研究結(jié)論和意義:
　　 本研究通過闡述卵巢癌細(xì)胞中NA

14、C1分子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組，揭示了參與NAC1信號通路的重要腫瘤相關(guān)分子通路。通過闡述NAC1分子在基因表達(dá)及活性調(diào)控層面對FOXQ1分子的作用，進(jìn)一步揭示了FOXQ1分子在NAC1信號通路介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲過程中的重要功能。為未來開展針對NAC1過表達(dá)腫瘤進(jìn)行的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了良好的理論依據(jù)。
　　 第二部分 FOXQ1在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究
　　 研究背景和目的:
　　 上述研究表明，在卵巢

15、高級別漿液性癌中，與腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥相關(guān)的重要基因NACC1可以顯著上調(diào)其下游基因FOXQ1的表達(dá)，而異位表達(dá)FOXQ1可以部分逆轉(zhuǎn)由于NAC1下調(diào)所導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力降低。從而提示，F(xiàn)OXQ1可能在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中也具有一定的作用。FOXQ1屬于Forkheadbox(FOX)轉(zhuǎn)錄因子家族，此家族分子的共同特征是含有一段保守的由110個(gè)氨基酸組成的序列，該序列通過與DNA特異結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)調(diào)控功能。FOX家族至少有

16、17個(gè)亞家族，包含至少43種不同的分子。FOX家族分子參與多種生物學(xué)活性的調(diào)控，如細(xì)胞代謝、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增生、凋亡等。而FOX家族成員FOXO，F(xiàn)OXM，F(xiàn)OXP，F(xiàn)OXC，F(xiàn)OXA和FOXQ，均被報(bào)道與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)。
　　 2001年首次確定并分離出FOXQ1分子，其由FOXQ1基因編碼，是一段由403個(gè)氨基酸組成的蛋白分子。研究發(fā)現(xiàn)，此分子在胚胎干細(xì)胞和脊椎動物發(fā)育過程中起重要作用，通過接受HOXA

17、1和HOXC13基因的調(diào)控作用來行使生物學(xué)功能。另外，F(xiàn)OXQ1在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中也具有重要功能，此過程與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。臨床研究表明，F(xiàn)OXQ1上調(diào)與結(jié)直腸癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌病人的不良預(yù)后顯著相關(guān)。雖然FOXQ1在腫瘤生物學(xué)中具有重要作用，然而至今仍沒有關(guān)于FOXQ1與卵巢癌病理生理發(fā)展的相關(guān)研究和報(bào)道?；诖?，我們進(jìn)行了FOXQ1在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中可能參與的分子機(jī)制研究。

18、>　　 研究方法和結(jié)果:
　　 通過分析上皮性卵巢癌基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)庫。我們發(fā)現(xiàn)，無論在Ⅰ型或Ⅱ型上皮性卵巢癌，F(xiàn)OXQ1分子均呈高表達(dá)狀態(tài)。與正常卵巢上皮細(xì)胞相比，F(xiàn)OXQ1在卵巢透明細(xì)胞癌、內(nèi)膜樣癌、粘液性癌及高級別漿液性癌中的表達(dá)均顯著升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別是:p＜0.01，p＜0.0001，p＜0.01，和p＜0.0001）。與正常的輸卵管上皮相比，F(xiàn)OXQ1在內(nèi)膜樣和高級別漿液性卵巢癌中的高表達(dá)具有顯著差異

19、（分別是:p＜0.001和p＜0.0001)。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測9種卵巢癌細(xì)胞系中FOXQ1的表達(dá)情況，結(jié)果再次證明，F(xiàn)OXQ1在所有的卵巢癌細(xì)胞系中均表達(dá)升高且差異顯著(p＜0.01)。之后，我們以高表達(dá)FOXQ1分子的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，利用RNA干擾的方法，分析FOXQ1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中可能參與的生物學(xué)機(jī)制。發(fā)現(xiàn)FOXQ1分子降表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞增生和克隆形成能力明顯降低;細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)因子表達(dá)發(fā)生明