miRNA-200家族在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其分子作用機(jī)制的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌(EOC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年有>23000例新發(fā)及>14000例死亡病例。臨床上大多數(shù)EOC患者在就診時(shí)都已處于腫瘤晚期，晚期上皮性卵巢癌的5年生存率低于30％。目前對(duì)導(dǎo)致這一惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的分子作用機(jī)理仍知之甚少，臨床上對(duì)EOC的早期篩查和早期診斷的難度較大。因此尋找可以在高危人群中篩選、協(xié)助早期診斷EOC的患者腫瘤分子標(biāo)志物及其相關(guān)分子機(jī)制一直是國內(nèi)外腫瘤學(xué)者研究的熱點(diǎn)。近年來，隨著基因技術(shù)的快速

2、發(fā)展，腫瘤分子標(biāo)志物的研究方向已經(jīng)從CA125、CA199等蛋白質(zhì)層面深入到了更本質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄層面。微小RNA(miRNA)是一類長約19～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，通過與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3'UTR)互補(bǔ)配對(duì)使目標(biāo)mRNA分子受到翻譯水平調(diào)控或直接導(dǎo)致其降解，參與調(diào)控細(xì)胞生長分化、能量代謝、凋亡等各個(gè)重要而基本的細(xì)胞生理過程。miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)作用的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，因此其作為新的腫瘤

3、分子標(biāo)志物具有較好的應(yīng)用前景。miRNA-200家族在EOC中的表達(dá)較其它miRNA高，且與正常卵巢組織中的表達(dá)相比在EOC中明顯過度表達(dá)。細(xì)胞的表型改變，即上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要步驟。miRNA-200家族還參與調(diào)節(jié)其預(yù)測(cè)靶基因之一—上皮鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB及其信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)ZEB1/deltaEF1、ZEB2/SIP1，從而通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的EMT與MET（間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變）的平衡，最終影響EOC的發(fā)生、發(fā)

4、展。
　　目前檢測(cè)miRNA表達(dá)最靈敏、可靠的方法是實(shí)時(shí)定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)，但常規(guī)的qPCR無法擴(kuò)增只有19～25個(gè)核苷酸組成的miRNA分子，需要特殊的設(shè)計(jì)或?qū)悠诽貏e處理，常用的處理方法主要包括莖環(huán)法和PAP法。2005年，Chen等設(shè)計(jì)出一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，以此代替常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的隨機(jī)引物或oligo(dT)引物，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，簡稱莖環(huán)法；同年，Shi等利用大腸

5、桿菌poly(A)聚合酶將RNA加上poly(A)尾，用含oligo(dT)的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對(duì)產(chǎn)物用熒光染料SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)，簡稱PAP法。莖環(huán)法的特異性和靈敏度比PAP法高，但引物設(shè)計(jì)難度大，檢測(cè)通量低；PAP法引物設(shè)計(jì)難度較低，檢測(cè)通量較高，但特異性和靈敏度較差。PAP法實(shí)時(shí)定量PCR適于大規(guī)模miRNA篩選實(shí)驗(yàn)，而本研究采用的莖環(huán)法實(shí)時(shí)定量PCR則適于有針對(duì)性地檢測(cè)小規(guī)模miRNA。
　　除

6、ZEB以外，轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β2、胰島素樣生長因子受體IGF-1R也是Target Scan軟件對(duì)miRNA-200家族的常見的預(yù)測(cè)靶基因，TGF-β2及IGF-1R在EOC中高表達(dá)，TGF-β2信號(hào)通路及IGF-1R信號(hào)通路也參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一—EMT，但國內(nèi)外也尚未有研究證實(shí)TGF-β2、IGF-1R是miRNA-200家族的靶基因，TGF-β2、IGF-1R與miRNA-200家族在EOC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)

7、制仍需深入研究。
　　目的：在基因水平及蛋白水平檢測(cè)miRNA-200家族中的miRNA-200a、miRNA-200c及其預(yù)測(cè)靶基因TGF-β2、IGF-1R在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)，探討它們的相關(guān)性及其與臨床病理特征間的關(guān)系，為探索miRNA-200家族及其預(yù)測(cè)靶基因在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，為發(fā)掘 miRNA-200家族作為新一代的上皮性卵巢癌早期診斷的腫瘤分子標(biāo)志物的可行性提供理論基礎(chǔ)。

8、　　方法：采用莖環(huán)實(shí)時(shí)定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative PCR)TaqMan探針法檢測(cè)2010年10月至2011年5月在廣東省人民醫(yī)院行手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理確診的35例上皮性卵巢癌、15例良性上皮性卵巢腫瘤及10例正常卵巢的組織標(biāo)本中miRNA-200a、 miRNA-200c的相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用免疫組化SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法）檢測(cè)上述組織中TGF-β2、IGF-1R蛋白表達(dá)，

9、所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS.13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，miRNA-200a、miRNA-200c的相對(duì)表達(dá)量為計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-Smirno檢驗(yàn)為不符合正態(tài)分布，三組間比較用Kruskal-wallis Test，組間兩兩比較用mann-whitney檢驗(yàn)，以X± S表示。TGF-β2、IGF-1R各組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)或fisher確切概率法檢驗(yàn)，miRNA-200a、miRNA-200c和TGF-β2、IGF

10、-1R之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。雙側(cè)P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、上皮性卵巢癌組織中miRNA-200a、miRNA-200c的相對(duì)表達(dá)量(376.80±109.25；392.73±110.11)均高于良性卵巢腫瘤(24.71±6.48；28.33±13.27)及正常卵巢組織(4.65±2.73；3.65±2.01)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，后兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上

11、皮性卵巢癌組織中miRNA-200a與miRNA-200c的相對(duì)表達(dá)量存在正相關(guān)關(guān)系,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.790，P<0.01）。
　　2、免疫組化SP法檢測(cè)TGF-β2、IGF-1R蛋白在上皮性卵巢癌組織中陽性表達(dá)率分別為(85.71%；88.57%)，高于卵巢良性腫瘤(40％；46.7%)及正常卵巢(30％；40%)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，后兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3、

12、上皮性卵巢癌組織中miRNA-200a相對(duì)表達(dá)量與TGF-β2、IGF-1R蛋白的表達(dá)均存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系(r=-0.603； r=-0.531，P<0.01)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、miRNA-200a、miRNA-200c的表達(dá)與臨床分期進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與卵巢子宮內(nèi)膜樣癌類型存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與組織分化無關(guān)。TGF-β2、IGF-1R蛋白的表達(dá)均與臨床分期進(jìn)展呈正相關(guān)（P

13、<0.05），TGF-β2蛋白在卵巢漿液性癌病理類型中較其它兩種病理類型高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。
　　結(jié)論：1、miRNA-200家族在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制中可能具有類似癌基因和抑癌基因的雙重性作用：①miRNA-200家族在上皮性卵巢癌組織較良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織的高表達(dá)，表明miRNA-200家族在上皮性卵巢癌的發(fā)生中可能發(fā)揮著類似致癌基因的作用

14、。②miRNA-200a、miRNA-200c及其預(yù)測(cè)靶基因TGF-β2、IGF-1R蛋白在EOC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并隨著臨床分期的進(jìn)展分別呈下降及上升趨勢(shì)，提示可能存在IGF-1R/TGF-β2/miRNA-200的信號(hào)通路網(wǎng)，不僅高表達(dá)的miRNA-200家族可能通過與預(yù)測(cè)靶基因TGF-β2、IGF-1R結(jié)合，發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在翻譯水平抑制TGF-β2、IGF-1R的表達(dá)，抑制EMT而誘導(dǎo)MET，抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，表明m

15、iRNA-200家族在EOC的發(fā)展中可能發(fā)揮著類似抑癌基因的作用；而且TGF-β2、IGF-1R也可能可以反過來下調(diào)miRNA-200家族的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT而抑制MET，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。IGF-1R/TGF-β2/miRNA-200信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)EMT與MET的平衡，參與上皮性卵巢癌的分子相關(guān)機(jī)制并在病情演變及進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。
　　2、miRNA-200家族有可能作為一種極具潛力的新一代的腫瘤分子標(biāo)志物應(yīng)用