53BP1在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制的研究.pdf

1、卵巢癌，尤其是上皮性卵巢癌，是威脅全世界女性健康的惡性腫瘤之一。WTO統(tǒng)計資料顯示:在全世界女性生殖道惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率均僅次于宮頸癌而位居第二位，因此有必要研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律及機制，為尋求有效的治療方法，改善患者預(yù)后奠定基礎(chǔ)。近年來，隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)卵巢癌也是一種基因型疾病，其形成和病情演進與基因突變有關(guān)，包括抑癌基因的失活或者癌基因的激活。53BP1是內(nèi)源性雙鏈DNA損傷的標志分子之一，主要參

2、與DNA損傷修復(fù)反應(yīng)，觸發(fā)受損細胞的周期阻滯以穩(wěn)定細胞的遺傳信息，從而防止腫瘤的形成和進展。本課題主要探討53BP1在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制，目前國內(nèi)外鮮有這方面的報道。課題的研究內(nèi)容主要包括以下部分:
　　 一、53BP1對卵巢癌細胞增殖能力影響的研究;
　　 二、53BP1對卵巢癌細胞侵襲能力及順鉑耐藥性影響的研究;
　　 三、53BP1對卵巢癌細胞裸小鼠致瘤能力影響的研究。
　　 第

3、一部分:53BP1對卵巢癌細胞增殖能力影響的研究
　　 背景和目的:目前，研究者對53BP1在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)體系中的重要作用已經(jīng)做了大量的研究。但是53BP1究竟在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演什么角色，迄今為止鮮有報道。此項研究的目的就是調(diào)節(jié)上皮性卵巢癌細胞中53BP1基因的表達水平，觀察53BP1蛋白改變對上皮性卵巢癌細胞增殖能力的影響，并探求由53BP1觸發(fā)的相應(yīng)機制。材料和方法:選取上皮性卵巢癌SKOV3細胞作為研

4、究對象，通過DNA脂質(zhì)體將53BP1的表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞，使SKOV3細胞中的53BP1蛋白過表達或者降調(diào)解。分別通過MTT實驗，克隆形成能力實驗及流式細胞儀檢測分析SKOV3細胞的生長曲線、克隆形成率、細胞周期及凋亡率，分析53BP1蛋白改變后，SKOV3細胞的增殖能力的變化。Westernblot檢測Bcl-2，p-Akt，Bax及P21waf(1)/cip(1)等細胞因子的表達情況。結(jié)果:當SKOV3細胞中

5、53BP1蛋白過表達時，其生長速度變慢，克隆形成能力減弱（過表達組SKOV3/pLPC-53BP1細胞:(1)34±9克隆/500細胞，對照組SKOV3/pLPC-vector細胞:(5)2±22克隆/500細胞），另外細胞表現(xiàn)出G2/M期阻滯（過表達組:26.68±2.11％，對照組13.02±1.30％），細胞凋亡率增加(過表達組:23.48±3.20％，對照組:9.34±2.12％)(P＜0.05)。細胞中誘導(dǎo)凋亡及細胞周期阻滯的

6、蛋白，Bax及P21waf(1)/cip(1)，表達增強。凋亡抑制因子及促增殖蛋白，Bcl-2及p-Akt，表達減弱。當降調(diào)SKOV3細胞中的53BP1蛋白時，其結(jié)果與過表達實驗相一致。結(jié)論:53BP1通過抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖能力阻滯其發(fā)生發(fā)展。
　　 第二部分:53BP1對卵巢癌細胞侵襲能力及順鉑耐藥性影響的研究
　　 背景和目的:卵巢癌預(yù)后差，一是因為癌細胞在盆腔及腹腔的廣泛播散致使手術(shù)治療不徹底;二是緣于癌細

7、胞對藥物產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥性，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。本部分研究的目的是探討53BP1與卵巢癌細胞侵襲能力及順鉑耐藥性之間的關(guān)系及其相關(guān)機制。材料和方法:通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，改變上皮性卵巢癌細胞SKOV3中53BP1的表達水平.通過transwell侵襲實驗計數(shù)穿膜貼壁細胞的數(shù)目，檢測過表達組SKOV3/pLPC-53BP1細胞，干擾組SKOV3/pSUPER-53BP1細胞及其相應(yīng)對照組SKOV3/pLPC-vector細胞，SKO

8、V3/pSUPER-vector細胞侵襲能力的改變。明膠酶譜法檢測細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及MMP-9的表達情況。MTT及westernblot方法分別檢測不同濃度的順鉑作用72小時后，53BP1對各組細胞化療敏感性的影響及相關(guān)蛋白的表達水平改變。結(jié)果:與對照組SKOV3/pLPC-vector細胞（230±58細胞）相比較，過表達組SKOV3/pLPC-53BPl細胞的侵襲能力明顯減弱（45±12細胞）(P＜0.05)，MMP-

9、9分泌水平明顯下降，而兩組間MMP-2分泌量無明顯差異(P＞0.05)。但是53BP1增加了卵巢癌細胞對于順鉑的耐藥性（過表達組SKOV3/pLPC-53BP1細胞的IC50為7.58±0.51μg/ml，而對照組SKOV3/pLPC-vector細胞的IC50為2.98±0.27μg/ml。P＜0.01）。隨著順鉑作用濃度的逐漸增加，SKOV3/pLPC-53BP1細胞中P21waf(1)/cip(1)及Bax蛋白表達量呈下降趨勢，而

10、p-Akt、Bcl-2蛋白表達量呈上升趨勢。當SKOV3細胞中的53BP1蛋白表達降低時，侵襲和順鉑耐藥性實驗結(jié)果與過表達實驗相一致。結(jié)論:53BP1通過降調(diào)節(jié)MMP-9的分泌水平抑制SKOV3細胞的侵襲能力;但是53BP1卻增加了順鉑作用下卵巢癌細胞的凋亡抑制因子的蛋白水平，增加了SKOV3細胞的順鉑化療耐藥性。
　　 第三部分:53BP1對卵巢癌細胞裸小鼠致瘤能力影響的研究
　　 背景和目的:借助腫瘤動物模型，人們能

11、夠更深刻的認識人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，評價腫瘤治療方法的優(yōu)劣。動物移植瘤模型的形成與否很大程度上依賴于腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因可以降低或逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的成瘤率。我們在前兩部分的研究證實細胞中53BP1蛋白水平改變可以影響卵巢癌細胞SKOV3的生物學(xué)行為，削減其增殖和侵襲能力，本部分研究的目的是探討53BP1對于裸小鼠卵巢癌皮下移植瘤形成的影響。材料和方法:將前期穩(wěn)篩成功的卵巢癌細胞（過表達組SKOV3/pLPC-53

12、BP1細胞及干擾組SKOV3/pSUPER-53BP1，其對照組分別為SKOV3/pLPC-vector細胞和SKOV3/pSUPER-vector細胞）接種于裸小鼠皮下（每組8只裸小鼠），觀察并比較各組動物的腫瘤形成時間，裸小鼠生物學(xué)行為的改變，測量移植瘤的大小及生長速度，應(yīng)用Kaplan-Meier及l(fā)og-rank方法分析各組荷卵巢癌裸小鼠生存時間的差異，探討53BP1對于裸小鼠皮下移植瘤致瘤能力的影響。結(jié)果:四種卵巢癌細胞的裸小

13、鼠皮下移植瘤成功率均為100％。裸小鼠皮下成瘤時間過表達組SKOV3/pLPC-53BP1細胞最長為28.50±2.07天，移植瘤大小為0.53±0.12cm（接種60天時），其對照組SKOV3/pLPC-vector細胞成瘤時間為22.88±2.90天，移植瘤大小1.12±0.23cm（接種60天時）(P＜0.05);干擾組SKOV3/pSUPER-53BP1細胞成瘤時間最短為14.88±1.46天，移植瘤大小2.52±0.72cm（

14、接種60天時），其對照組SKOV3/pSUPER-vector細胞成瘤時間為20.75±5.34天，移植瘤大小0.94±0.11cm（接種60天時）(P＜0.05)。Kaplan-Meier及l(fā)og-rank結(jié)果顯示SKOV3/pLPC-53BP1組荷瘤裸小鼠生存時間較SKOV3/pLPC-vector組明顯延長（分別為110±5.15天及100±2.97天，P＜0.01），SKOV3/pSUPER-53BP1組荷瘤裸小鼠生存時間明顯較