雌鼠骨髓干細(xì)胞離體表達(dá)Oct4、Vasa、Stra8和Scp3的研究.pdf

1、目的： 探索成年雌鼠骨髓干細(xì)胞（female bone marrow stem cells，F(xiàn)BMSCs）離體培養(yǎng)條件下是否表達(dá)多能干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞表達(dá)的基因Oct4、原始生殖細(xì)胞開始分化至減數(shù)分裂后期產(chǎn)生配子的生殖細(xì)胞特異表達(dá)的標(biāo)志基因Vasa、以前研究認(rèn)為僅在雌性胚胎生殖干細(xì)胞由有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂前表達(dá)的標(biāo)志基因Stra8及減數(shù)分裂標(biāo)志基因Scp3，判斷FBMSCs是否有向卵母細(xì)胞樣細(xì)胞分化的能力。 方法：

2、 全骨髓貼壁法分離青年雌性SD大鼠FBMSCs，傳代培養(yǎng)第三代FBMSCs用DMEM+15％胎牛血清培養(yǎng)，全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）組加入終濃度為10-5 Mol/L的ATRA；RT-PCR方法檢測(cè)FBMSCs的Oct4、Vasa、Stra8及Scp3 mRNA的表達(dá)；Oct4和Stra8基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA測(cè)序法雙向測(cè)定cDNA序列；用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)FBMSCs的SCP3

3、蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.ATRA組部分FBMSCs分化成為大小不一、呈圓形或球形的細(xì)胞，分化的大而圓形細(xì)胞周圍有數(shù)個(gè)小細(xì)胞環(huán)繞，對(duì)照組FBMSCs細(xì)胞比較均一呈長(zhǎng)梭形。 2.對(duì)照組和ATRA組連續(xù)培養(yǎng)8天都可檢測(cè)到早期生殖干細(xì)胞標(biāo)志基因Oct4、Vasa mRNA及生殖干細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)標(biāo)志基因Stra8 mRNA在誘導(dǎo)分化的FBMSCs中表達(dá)。并且Oct4和Stra8基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中序

4、列基本一致，Oct4的序列同源性大于99％，Stra8的序列同源性為100％。 3.ATRA組培養(yǎng)第8天開始檢測(cè)到生殖細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)志基因Scp3 mRNA的表達(dá)，并于第15天也有表達(dá)，但對(duì)照組未檢測(cè)到Scp3 mRNA表達(dá)。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)顯示， ATRA組培養(yǎng)第10、15、29天的FBMSCs部分細(xì)胞分化成為中等大小球形或圓形的SCP3陽(yáng)性細(xì)胞，呈簇狀分布，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞增多，細(xì)胞體積增大。而對(duì)照組第1

5、5天開始有少量表達(dá)，也隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞增多，細(xì)胞體積增大。 結(jié)論： 1.對(duì)照組和ATRA組培養(yǎng)8天內(nèi)均可誘導(dǎo)FBMSCs表達(dá)早期生殖干細(xì)胞標(biāo)志Oct4、Vasa mRNA及生殖干細(xì)胞由有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂前特異表達(dá)基因Stra8 mRNA，表明FBMSCs中具有能向卵母細(xì)胞分化的多能干細(xì)胞，減數(shù)分裂啟動(dòng)標(biāo)志基因Stra8不僅在雌性胚胎生殖干細(xì)胞表達(dá)，也在成年雌性骨髓中的有向生殖干細(xì)胞分化能力的細(xì)胞中表達(dá)，提

6、示成年雌性有新的卵母細(xì)胞生成的可能。 2.減數(shù)分裂期特異標(biāo)志基因Scp3 mRNA只在ATRA誘導(dǎo)的FBMSCs中才有表達(dá)。ATRA組培養(yǎng)第8天開始檢測(cè)到Scp3 mRNA，并于第15天也有表達(dá)，而對(duì)照組不表達(dá)Scp3 mRNA，可能與本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件有限，長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少造成所提取的mRNA的量不足導(dǎo)致檢測(cè)不到有關(guān)。 3.ATRA培養(yǎng)可誘導(dǎo)FBMSCs表達(dá)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂期特異標(biāo)志SCP3蛋白質(zhì)，表明FBMSCs