骨髓干細(xì)胞移植治療ALS模型鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一種成年起病的慢性進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性病變，患者以上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性損害為特點(diǎn)，表現(xiàn)為進(jìn)行性肌肉無力、萎縮，肌肉跳動(dòng)和腱反射亢進(jìn)、病理反射陽性等癥狀和體征。一般不影響感覺系統(tǒng)、智能和認(rèn)知。中年男性多見，病后3～5年死亡。約10％的病例有顯性遺傳的家族史，其中20％與銅鋅超氧化物岐化酶(Cu，ZnSuperoxidedismutase，SOD1)

2、基因突變有關(guān)。目前已創(chuàng)建了幾種表達(dá)突變?nèi)薙OD1基因的轉(zhuǎn)基因模型鼠，其中最早創(chuàng)建也是應(yīng)用最廣泛的是SOD1-G93A小鼠(簡(jiǎn)稱ALS鼠)——它攜帶能表達(dá)人Gly93Ala(氨基酸鏈上第93位甘氨酸被丙氨酸替代)錯(cuò)義突變的SOD1基因，最終在小鼠發(fā)展為類人ALS的表現(xiàn)。在ALS中，突變SOD1的致病機(jī)制學(xué)說有：突變SOD1蛋白獲得毒性功能、興奮性氨基酸毒性、神經(jīng)絲蛋白異常磷酸化和聚集、免疫、病毒感染等。 總的來說，ALS欠缺有效的

3、治療方式，目前許多研究者主要從如下3個(gè)方面挖掘有治療意義的方法：藥物治療、基因治療和細(xì)胞治療。盡管迄今為止已篩選了幾百種藥物，只有力魯唑被美國FDA認(rèn)可為ALS的治療藥物，但是該藥的作用還遠(yuǎn)未能達(dá)到增加ALS患者生存期的目的。部分細(xì)胞因子(腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子等)在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得較為肯定延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和模型鼠生存時(shí)間的療效，但臨床試驗(yàn)的結(jié)果卻不樂觀，可能與細(xì)胞因子在體內(nèi)受到復(fù)雜因素的干擾有關(guān)?；蛑委煱ㄅc細(xì)胞因子、凋亡相關(guān)的基因策

4、略，如利用病毒等載體攜帶相關(guān)基因進(jìn)入病變組織并表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，該種方式使細(xì)胞因子較穩(wěn)定地存留于靶組織，但病毒載體的潛在危險(xiǎn)性，以及表達(dá)相關(guān)基因的穩(wěn)定性如何，都是ALS移植鼠變性線粒體的百分率明顯少于ALS對(duì)照組，在神經(jīng)元胞體、樹突和有髓鞘軸突內(nèi)ALS移植鼠的線粒體變性的百分率比ALS對(duì)照組分別減少了25.89％，27.90％和42.26％。 (六)移植鼠體內(nèi)Sry和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，在高倍鏡下

5、小鼠Y染色體熒光為綠色或黃綠色，呈點(diǎn)狀或線樣分布于胞核內(nèi)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，脊髓中這些帶Sry熒光標(biāo)記的細(xì)胞散在分布，數(shù)量少。對(duì)同一移植鼠來源的約5～10個(gè)系列/只的連續(xù)切片進(jìn)行了細(xì)胞標(biāo)記和神經(jīng)標(biāo)記物的對(duì)比分析，結(jié)果為：在每個(gè)系列的連續(xù)切片上帶Sry標(biāo)記(移植細(xì)胞標(biāo)記)的細(xì)胞占一定視野中細(xì)胞總數(shù)百分率的均值為5.45‰±0.35‰(約1/200個(gè)細(xì)胞)，約80％的標(biāo)記細(xì)胞同時(shí)表現(xiàn)為神經(jīng)標(biāo)記物陽性，其中GFAP陽性細(xì)胞占標(biāo)記細(xì)胞的72％±6.1％

6、，NF陽性細(xì)胞占標(biāo)記細(xì)胞的8.8％±6.07％。 四、骨髓干細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)(一)ALS鼠組織內(nèi)MCP-1的表達(dá)量RT-PCR擴(kuò)增得到MCP-1及其內(nèi)參的表達(dá)量情況：ALS鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和正常鼠脊髓組織中均表達(dá)MCP-1，肝臟組織不表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示，MCP-1表達(dá)相對(duì)量，從少到多依次為：正常脊髓，ALS腦、腦干和脊髓。WesternBlot進(jìn)一步證實(shí)了RT-PCR的結(jié)果，并進(jìn)一步顯示19周齡ALS病鼠各組織中MCP-1表

7、達(dá)量較8～9周齡ALS鼠的明顯增高(P＜0.01)。 (二)骨髓干細(xì)胞的體外游走實(shí)驗(yàn)利用Transwell系統(tǒng)進(jìn)行骨髓干細(xì)胞體外游走實(shí)驗(yàn)的研究，對(duì)各組遷移到下室的骨髓干細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，顯示：ALS脊髓組的下室細(xì)胞數(shù)最多，而MCP-1阻斷組中下室細(xì)胞數(shù)較前者明顯減少，但仍然高于正常脊髓組。流式細(xì)胞分析遷移細(xì)胞CKR-2B(MCP-1受體)結(jié)果顯示空白對(duì)照組的CKR-2B表達(dá)率不到50％，正常脊髓組和ALS脊髓組中，兩組細(xì)胞CKR-2

8、B表達(dá)率接近，統(tǒng)計(jì)無顯著性差異(P＞0.01)，在細(xì)胞群間比較，單核細(xì)胞群的表達(dá)量比淋巴細(xì)胞群的更高(P＜0.01)。 結(jié)論1、B6SJLSOD1G93A/+鼠(ALS轉(zhuǎn)基因鼠)在行為學(xué)、電生理學(xué)、和病理學(xué)上的特點(diǎn)與人類ALS疾病非常相似，因此ALS轉(zhuǎn)基因鼠是研究人ALS疾病機(jī)制和治療策略的理想動(dòng)物模型。 2、本研究中所采用的放療移植方案——對(duì)7～9周齡ALS鼠行5.5～6.5Gy放射預(yù)處理一周左右進(jìn)行靜脈移植同種異基因

9、骨髓干細(xì)胞——是安全可行的(創(chuàng)新點(diǎn)一) 3、骨髓干細(xì)胞移植治療可明顯延長(zhǎng)ALS鼠的生存期達(dá)5周左右，并延緩顯著發(fā)病時(shí)間(創(chuàng)新點(diǎn)二)。 4、運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)、電生理學(xué)、病理學(xué)和生化學(xué)等指標(biāo)顯示移植鼠的殘存運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及其功能較同齡ALS對(duì)照鼠明顯增加，證實(shí)骨髓干細(xì)胞移植治療ALS鼠是有效的(創(chuàng)新點(diǎn)三)。 5、ALS脊髓組織中MCP-1表達(dá)異常上調(diào)，體外細(xì)胞游走實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)ALS鼠脊髓勻漿中的MCP-1可顯著增加骨髓