OCT4和SKOV3和SKOV3-DDP卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)差異分析.pdf

1、目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中較常見的惡性腫瘤，其死亡率占所有婦科惡性腫瘤的首位，已經(jīng)嚴(yán)重威脅婦女的生命和身體健康，其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）來源于卵巢表層的生發(fā)上皮，是最多見的卵巢癌。卵巢癌的高死亡率主要是由于卵巢位于盆腔深部，其起病隱匿，缺乏早期的特異性癥狀和體征，絕大多數(shù)初診時(shí)已為晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)，患者多已經(jīng)表現(xiàn)為盆腹腔播散轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。若卵巢癌初期被發(fā)現(xiàn)，其病變僅局限在卵巢包

2、膜內(nèi)（Ⅰ期），患者的5年生存率可達(dá)90％。目前，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類和紫杉醇類為主的術(shù)后輔助化療是卵巢癌首選的治療方案。雖然約70％-80％卵巢癌患者對鉑類為主的初始化療有效，但耐藥率甚高，5年生存率僅為20％-30％。那么，何為卵巢癌耐藥的根源，何種細(xì)胞因子能抑制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展呢？這是學(xué)者們目前的研究熱點(diǎn)，但迄今為止仍未有突破性的進(jìn)展。
　　近年來對干細(xì)胞的研究推動(dòng)了腫瘤學(xué)的發(fā)展，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長特點(diǎn)與干細(xì)胞有許多

3、相似之處，這就促成了“腫瘤干細(xì)胞(CSCs)”理論的提出?！澳[瘤干細(xì)胞”是指在腫瘤組織中所占比例非常少的一類具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，它具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能。腫瘤干細(xì)胞最早在白血病中發(fā)現(xiàn)，隨后在乳腺癌、肺腺癌和前列腺癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在。有學(xué)著認(rèn)為它們可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)和耐藥的關(guān)鍵。
　　腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞特性使我們有理由相信調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞生物學(xué)行為的信號因子也應(yīng)該可以作用于CSCs。OCT4、NA

4、NOG、KLF4以及SOX2是維持干細(xì)胞自我更新、無限增殖能力和多潛能性的主要信號分子，其中對OCT4的研究最多。信號分子Octamer4(OCT4)是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，在胚胎干細(xì)胞、成人干細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞中均呈高表達(dá)。Nature中一份研究表明OCT4的高表達(dá)可以維持胚胎干細(xì)胞的自我更新、無限增殖和多向分化潛能。小干擾RNA(siRNA)抑制OCT4的表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡并顯著抑制腫瘤的生長。發(fā)表在Cancer的一篇

5、文章研究顯示OCT4在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株中呈高表達(dá)，并且OCT4在低分化子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)高于高分化癌組織，其與腫瘤的分級呈負(fù)相關(guān)。由此我們設(shè)想耐藥的上皮性卵巢癌可能與OCT4的高表達(dá)有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)非耐藥人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系SKOV3，耐順鉑細(xì)胞系SKOV3/DDP，同時(shí)建立兩種細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型，旨在研究OCT4在耐藥和非耐藥卵巢癌細(xì)胞株及移植瘤中的表達(dá)情況，探討OCT4與上皮性卵巢癌

6、耐藥的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系SKOV3和耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置于37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中。
　　2.體內(nèi)移植瘤模型建立:常規(guī)體外培養(yǎng)非耐藥人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系SKOV3，耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶底80％-90％時(shí)收集細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，制成5×107個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，分別以每

7、只裸鼠0.2ml（即1×107個(gè)細(xì)胞）于無菌條件下接種于裸鼠背側(cè)近后肢處的皮下。測量移植瘤的大小，在最長徑達(dá)0.5-0.8cm（10天左右）時(shí)將腫瘤取出，部分立即放入液氮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用，部分制成單細(xì)胞懸液，以備流式細(xì)胞檢測。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù):應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測細(xì)胞水平和移植瘤組織中OCT4蛋白的表達(dá)水平。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù):取出未經(jīng)試劑固定、保存于液氮罐中的移植瘤組織，用RT-qPCR技術(shù)檢測移植瘤組織

8、和癌細(xì)胞株中mRNA-OCT4的表達(dá)情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)分析，結(jié)果以(x)±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.在體外培養(yǎng)中，與非耐藥SKOV3細(xì)胞株相比，耐藥SKOV3/DDP細(xì)胞中OCT4在mRNA和蛋白質(zhì)水平均表現(xiàn)為高表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示:與ISO type同型對照相比，OCT4陽

9、性表達(dá)細(xì)胞高達(dá)92.8％，而非耐藥SKOV3細(xì)胞株流式分析陽性表達(dá)率僅為52.9％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.在體內(nèi)裸鼠移植瘤模型中，耐藥SKOV3/DDP移植瘤流式細(xì)胞分析中OCT4陽性細(xì)胞為3.7％，而非耐藥SKOV3移植瘤中OCT4陽性率為2.5％。同時(shí)應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測兩種裸鼠移植瘤中mRNA-OCT4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)耐藥SKOV3/DDP移植瘤中mRNA-OCT4的表達(dá)量高于非耐藥SKOV3移植瘤